วิธีเลือก Blocking Buffer สำหรับ Western Blot: BSA vs Milk vs ผลิตภัณฑ์สำเร็จรูป
ปัญหาฝ้าสีเทาบนเมมเบรน แถบเงา (phantom bands) หรือสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์ที่ลดลง มักเกิดจากการเลือก blocking buffer ไม่เหมาะสม การเลือกใช้ blocking buffer ราคา ประหยัดหรือคุณภาพสูงนั้นมีความสำคัญ โปรตีนเคซีน (casein) ในนมอาจบดบัง phospho-epitopes และไบโอตินในนมอาจรบกวนระบบ streptavidin รวมถึง BSA ที่ไม่บริสุทธิ์อาจเพิ่มสัญญาณรบกวน (background) แทนที่จะลดลง คู่มือนี้จะช่วยให้คุณเลือกใช้ blocking buffer ไม่ว่าจะเป็น BSA, นม หรือผลิตภัณฑ์สำเร็จรูป ให้เหมาะสมกับกลุ่มโปรตีนเป้าหมาย เมมเบรน และระบบตรวจวัดของคุณได้อย่างมั่นใจ
ทำไมการเลือก Blocker จึงสำคัญ และควรตัดสินใจเมื่อไหร่
กระบวนการ Blocking ทำหน้าที่เติมเต็มตำแหน่งที่ว่างบนเมมเบรนหลังการถ่ายโอนโปรตีน หากเลือกสารเคมีผิด แอนติบอดีจะจับแบบไม่จำเพาะเจาะจง สัญญาณของคุณอาจหายไป หรือสัญญาณรบกวนจะกลบข้อมูลที่มีประโยชน์ทั้งหมด การตัดสินใจเรื่อง blocking buffer ราคา และประเภทของสารต้องทำก่อนเริ่มบ่มแอนติบอดีปฐมภูมิ ไม่ใช่หลังจากพบว่าการทดลองล้มเหลว
ปัจจัย 3 ประการที่กำหนดการเลือก ได้แก่ ประเภทเมมเบรน (PVDF หรือ nitrocellulose), ความจำเพาะของแอนติบอดี (โดยเฉพาะสำหรับเป้าหมาย phospho หรือ glyco) และระบบตรวจวัด (HRP, AP หรือฟลูออเรสเซนซ์) การเข้าใจ การแยกโปรตีนด้วย SDS-PAGE ช่วยให้คุณคาดการณ์ได้ว่าคุณภาพการถ่ายโอนโปรตีนจะมีผลต่อขั้นตอนการ Blocking อย่างไร
| Blocker | เหมาะที่สุดสำหรับ | ควรหลีกเลี่ยงเมื่อ | ความเข้ากันได้ของการตรวจวัด |
|---|---|---|---|
| BSA (3–5%) | Phospho-targets, kinases, glycoproteins | งานประจำที่เน้นประหยัดต้นทุน | HRP, AP, fluorescence |
| นมผงพร่องมันเนย (5%) | เป้าหมายที่มีปริมาณมาก, งานประจำ | Phospho-epitopes, ระบบไบโอติน | HRP, AP |
| ผลิตภัณฑ์สำเร็จรูป | ฟลูออเรสเซนซ์, มัลติเพล็กซ์, ไบโอติน-สเตรปทาวิดิน | ไม่จำเป็นสำหรับงาน HRP ทั่วไป | Fluorescence, HRP, AP |
สิ่งที่คุณต้องเตรียม: เมมเบรน แอนติบอดี และ Blocker
เมมเบรนและอุปกรณ์
คุณต้องใช้เมมเบรน PVDF หรือ nitrocellulose, เครื่องเขย่า, ถาดเรียบที่สะอาด และปิเปตที่ผ่านการสอบเทียบ ไซริงค์ฟิลเตอร์ขนาด 0.2 ถึง 0.45 ไมโครเมตร ช่วยกำจัดอนุภาคออกจากบัฟเฟอร์ที่เตรียมใหม่ได้ ปัญหาขอบภาพหรือจุดกระดำกระด่างมักเริ่มจากจุดนี้ ดังนั้นเครื่องแก้วที่สะอาดและความเร็วในการเขย่าที่คงที่จึงเป็นเรื่องสำคัญ
บัฟเฟอร์และสารลดแรงตึงผิว
ใช้ PBS หรือ TBS เป็นบัฟเฟอร์พื้นฐาน เติม Tween 20 ปริมาณ 0.05 ถึง 0.1 เปอร์เซ็นต์เพื่อลดการจับแบบไม่จำเพาะเจาะจงแบบ hydrophobic ใช้น้ำที่สะอาดและผ่านการเตรียมใหม่ ซึ่งผ่านการกรองหรือ Deionised สำหรับการเจือจางทั้งหมด
น้ำยา Blocking และอุปกรณ์ตรวจวัด
สำหรับ BSA เกรดรีเอเจนต์ที่มีความบริสุทธิ์สูงและสม่ำเสมอในแต่ละ Lot กลุ่มผลิตภัณฑ์ Albumins and Transport Proteins ของ Merck มีอัลบูมินจากวัวที่เหมาะสำหรับการประยุกต์ใช้ในอิมมูโนแอสเซย์ นมผงต้องเป็นแบบพร่องมันเนยเพื่อป้องกันการรบกวนจากไขมัน สำหรับการอ่านค่า HRP หรือ AP chemiluminescence พอร์ตโฟลิโอ Immunodetection Reagents and Substrates ของ Merck ครอบคลุมถึงซับสเตรตและชุดตรวจวัดที่ใช้งานร่วมกับ Blocker ที่คุณเลือกได้ทันที
สำหรับขั้นตอนการตรวจวัด ทั้ง Monoclonal Antibodies และ Polyclonal Antibodies มีจำหน่ายผ่านช่องทางของ Merck และ TCI คุณสามารถสำรวจรายการวัสดุสิ้นเปลืองสำหรับ protein electrophoresis and western blotting ทั้งหมดเพื่อเตรียม Workflow ของคุณให้สมบูรณ์
การเลือก BSA, นม หรือผลิตภัณฑ์สำเร็จรูป
เมื่อไหร่ที่ควรเลือก BSA
BSA เป็น Blocker มาตรฐานสำหรับแอนติบอดีที่จำเพาะต่อ phospho และเป้าหมาย phospho-kinase เคซีน ซึ่งเป็นโปรตีนหลักในนมผง เป็นฟอสโฟโปรตีนเช่นกัน มันจะเข้าไปแย่งจับกับ phospho-epitopes โดยตรงและลดสัญญาณของแอนติบอดี เตรียมสารละลาย 3 ถึง 5 เปอร์เซ็นต์ใน PBS-T หรือ TBS-T สำหรับ Phospho blots นั้นแนะนำให้ใช้ TBS-T เพราะ PBS อาจทำให้เกิดการรบกวนทางไอออนในบางตำแหน่งของ phospho
ผลิตภัณฑ์ BSA ในกลุ่ม Albumins and Transport Proteins ของ Merck ได้รับการทดสอบแล้วว่ามีการปนเปื้อนของโปรตีเอสและ IgG ต่ำ ซึ่งช่วยป้องกันการเกิดแถบหลอก (false bands) ที่มักเกิดขึ้นในงานอิมมูโนแอสเซย์
เมื่อไหร่ที่นมให้ผลลัพธ์ที่ดี
นมผงพร่องมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์ใน PBS-T หรือ TBS-T มีความคุ้มค่าและให้ผลดีเยี่ยมสำหรับโปรตีนโครงสร้างหรือโปรตีนพื้นฐาน (housekeeping proteins) ที่ตรวจวัดด้วย HRP หรือ AP มันช่วยลดสัญญาณรบกวนสำหรับงานรูทีนได้เป็นอย่างดี ข้อจำกัดคือไม่สามารถใช้นมกับการตรวจวัดแบบ phospho และระบบที่ใช้ไบโอตินได้
เมื่อไหร่ที่ควรลงทุนกับ Commercial Blockers
การตรวจวัดแบบฟลูออเรสเซนซ์และ Western blots แบบมัลติเพล็กซ์ต้องการ Blocker ที่มีค่าการเรืองแสงในตัวเอง (autofluorescence) ต่ำ ซึ่งนมให้ไม่ได้ สูตรผลิตภัณฑ์สำเร็จรูปซึ่งมักมาในรูปแบบเข้มข้นพร้อมเจือจาง ได้รับการปรับแต่งมาเพื่อการใช้งานเหล่านี้โดยเฉพาะ และมีตัวเลือกที่ปราศจากเคซีนและไบโอติน
คู่มือตัดสินใจด่วน: เลือก Blocker ตัวไหนสำหรับงานของคุณ?
- แอนติบอดีที่จำเพาะต่อ phospho (pSer, pThr, pTyr)
- เป้าหมาย Phospho-kinase
- การตรวจวัด Glycoprotein
- เมื่อนมทำให้เกิดสัญญาณรบกวนบน PVDF
- โปรตีนโครงสร้างที่มีปริมาณมาก (actin, tubulin, GAPDH)
- งาน HRP หรือ AP chemiluminescence ทั่วไป
- ห้องแล็บที่เน้นความคุ้มค่าและปริมาณงานสูง
- เป้าหมายที่ไม่ใช่ phospho บน nitrocellulose
- งานฟลูออเรสเซนซ์หรือมัลติเพล็กซ์ Western blot
- ระบบตรวจวัดแบบไบโอติน-สเตรปทาวิดิน
- งาน Lectin-based assays
- สัญญาณรบกวนยังคงสูงแม้ใช้ BSA หรือนม
| ประเภทการตรวจวัด | กลุ่มเป้าหมาย | Blocker ที่เข้ากันได้ | หมายเหตุ |
|---|---|---|---|
| HRP chemiluminescence | โปรตีนโครงสร้าง/housekeeping | นม 5% หรือ BSA 3–5% | นมคุ้มค่า; BSA ให้ความคมชัดของแถบดีกว่า |
| HRP chemiluminescence | Phospho-proteins | BSA 3–5% ใน TBS-T | ห้ามนมเด็ดขาด; เคซีนจะรบกวน phospho-epitopes |
| AP detection | โปรตีนทั่วไป | นม 5% หรือ BSA 3% | หลีกเลี่ยงเอไซด์ในบัฟเฟอร์ |
| Fluorescence / multiplex | ทุกประเภท | Commercial fluorescence blocker | นมมีค่า autofluorescence สูง; BSA ใช้ได้ที่ความเข้มข้นต่ำ |
| Biotin-streptavidin | ทุกประเภท | BSA หรือ Commercial blocker ที่ไร้ไบโอติน | นมมีไบโอตินตามธรรมชาติ; ควรหลีกเลี่ยง |
เตรียม Blocking Buffer ให้ถูกต้อง
BSA Blocking Buffer
- ชั่งผง BSA 3 ถึง 5 กรัมโดยใช้ตาชั่งที่ผ่านการสอบเทียบ
- ละลายใน PBS หรือ TBS ปริมาณ 100 มิลลิลิตรที่มี Tween 20 ปริมาณ 0.05 ถึง 0.1 เปอร์เซ็นต์
- ผสมเบาๆ โดยการกลับขวดไปมาหรือใช้เครื่องกวนความเร็วต่ำจนสารละลายใส
- กรองผ่านเมมเบรน 0.45 ไมโครเมตรเพื่อกำจัดเศษตะกอน
- เก็บที่ 2 ถึง 8°C ได้นานสูงสุด 7 วันหากผ่านการฆ่าเชื้อด้วยการกรอง; ระบุวันที่เตรียม
Milk Blocking Buffer
- ชั่งผงนมผงพร่องมันเนย 5 กรัม
- เติมลงใน PBS-T หรือ TBS-T 100 มิลลิลิตรที่อุณหภูมิห้อง
- ผสมโดยใช้ Vortex หรือกลับขวดไปมาจนกระจายตัวดี ไม่ควรเหลือเกล็ดผง
- กรองผ่านเมมเบรน 0.45 ไมโครเมตรเพื่อกำจัดอนุภาคที่ทำให้เกิดจุดบนเมมเบรน
- ใช้ภายในวันเดียวกัน ห้ามเก็บข้ามคืน
Commercial Blocking Buffer
- ตรวจสอบคำแนะนำผลิตภัณฑ์สำหรับอัตราส่วนการเจือจาง ปกติคือ 1x ถึง 5x จากสต็อกเข้มข้น
- เลือกสูตรที่ปราศจากเคซีนสำหรับ phospho targets หรือรุ่นที่ปรับแต่งมาเพื่อฟลูออเรสเซนซ์สำหรับงานมัลติเพล็กซ์
- เตรียมปริมาตรใช้งานให้พอดีกับพื้นที่เมมเบรน; หลีกเลี่ยงการเตรียมเกินความจำเป็น
- ปฏิบัติตามฉลากเรื่องอุณหภูมิการเก็บรักษาและอายุการใช้งานหลังเปิดใช้
ใช้บัฟเฟอร์ 0.2 ถึง 0.4 มิลลิลิตรต่อตารางเซนติเมตรของเมมเบรนในถาดแบน เขย่าเบาๆ ตลอดเวลา Blocking เป็นเวลา 30 ถึง 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หรือขยายเวลาเป็น 2 ชั่วโมงที่ 4°C สำหรับเป้าหมายที่วิเคราะห์ยากหรือเมื่อใช้ Commercial blockers
เคล็ดลับด่วน: การเตรียมบัฟเฟอร์
- ควบคุม Tween 20 ให้คงที่ระหว่าง 0.05 ถึง 0.1 เปอร์เซ็นต์; มากไปจะทำลายสัญญาณ, น้อยไปจะเกิดสัญญาณรบกวนจาก hydrophobic
- ใช้ PBS-T สำหรับงานส่วนใหญ่; เปลี่ยนเป็น TBS-T สำหรับ phospho blots หากสัญญาณรบกวนยังคงมีอยู่
- แช่ PVDF ในเมทานอล 10 ถึง 15 วินาทีก่อนนำไปแช่บัฟเฟอร์
- กรองบัฟเฟอร์นมเสมอเพื่อป้องกันสิ่งเจือปนบนผิวเมมเบรน
- ระบุวันที่บนบัฟเฟอร์ทุกชนิด และทิ้งบัฟเฟอร์นมหลังจากผ่านไปหนึ่งวัน
ใช้ Block และตรวจสอบประสิทธิภาพ
- ล้างเมมเบรนด้วย PBS หรือ TBS หลังจากการถ่ายโอนทันทีเพื่อกำจัดสารตกค้าง
- เติม Blocking buffer ลงในถาด ให้เมมเบรนจมอยู่ใต้สารละลายทั้งหมด
- เขย่าเบาๆ บนเครื่องเขย่าตลอดระยะเวลา Blocking; อย่าปล่อยให้เมมเบรนนิ่งเพื่อป้องกันผลกระทบที่ขอบ
- ทิ้ง Blocking buffer หลังการใช้; ห้ามนำกลับมาใช้ซ้ำ
- ล้าง 3 ครั้งใน PBS-T หรือ TBS-T ครั้งละ 5 นาทีเพื่อกำจัด Blocker ส่วนเกิน
- บ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในความเข้มข้นที่แนะนำ เจือจางใน Blocking buffer เดียวกัน
- หลังบ่มแอนติบอดีปฐมภูมิ ล้างอีกครั้งก่อนเติมแอนติบอดีทุติยภูมิ
- ตรวจวัดโดยใช้ซับสเตรต HRP หรือ AP ที่เลือกจากกลุ่มผลิตภัณฑ์ Immunodetection Reagents and Substrates ของ Merck หรือดำเนินการด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิชนิดฟลูออเรสเซนซ์
รัน No-primary control ในทุกการทดลอง หากเปรียบเทียบ Blocker ให้ตัดเมมเบรนตามแนวตั้งแล้วแบ่งรันด้วย Blocker คนละตัว การเปรียบเทียบแบบ Side-by-side จะแสดงให้เห็นความแตกต่างของสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน (signal-to-noise) อย่างชัดเจน
หากสัญญาณรบกวนยังคงอยู่หลังอ่านค่า HRP ให้ลดความเข้มข้นของนมเหลือ 3 เปอร์เซ็นต์, เปลี่ยนไปใช้ BSA หรือเปลี่ยนไปใช้ Commercial blocker ทั้ง Monoclonal Antibodies และ Polyclonal Antibodies จาก Merck และ TCI เข้ากันได้กับวิธีการ Blocking ทั้งสามแบบเมื่อใช้ในความเข้มข้นที่ผ่านการรับรอง
เคล็ดลับและข้อควรระวังเพื่อผลลัพธ์ที่สะอาดขึ้น
เคล็ดลับด่วน: ผลลัพธ์ Western blot ที่ชัดเจนขึ้น
- คงค่า Tween 20 ไว้ที่ 0.05 ถึง 0.1 เปอร์เซ็นต์; การเกิน 0.1 เปอร์เซ็นต์มีความเสี่ยงต่อการทำลายอันตรกิริยาที่อ่อน
- เปลี่ยนบัฟเฟอร์ที่ใช้ล้างเมื่อเปลี่ยนการทดลอง Blocking; การปนเปื้อนข้ามระหว่างบัฟเฟอร์นมและ BSA จะทำให้การแก้ไขปัญหาทำได้ยาก
- ห้ามใช้บัฟเฟอร์นมซ้ำข้ามวัน; มันเสื่อมสภาพและทำให้เกิดสัญญาณรบกวน
- หลีกเลี่ยงโซเดียมเอไซด์ในทุกบัฟเฟอร์ที่มีการตรวจวัด HRP
- เปลี่ยนเป็น TBS-T สำหรับ phospho blots หาก PBS-T มีสัญญาณรบกวนสูง
- ลดการสัมผัสแสงระหว่างการทดลองเมื่อใช้แอนติบอดีทุติยภูมิชนิดฟลูออเรสเซนซ์
- กรองบัฟเฟอร์ทุกชนิดผ่านฟิลเตอร์ 0.2 ถึง 0.45 ไมโครเมตร
- หากคุณเริ่มต้นด้วยการค้นหา western blot blocking buffer BSA milk: ใช้ BSA สำหรับ phospho targets และใช้นมเฉพาะงาน chemiluminescence ทั่วไปที่ไม่ใช่โปรตีน phospho
การแก้ไขปัญหาทั่วไป
| ปัญหา | สาเหตุที่เป็นไปได้ | วิธีแก้ไข |
|---|---|---|
| สัญญาณรบกวนสูงทั่วเมมเบรน | เวลา Blocking ไม่พอ, Blocker เจือจางไป, Tween 20 น้อยไป | เพิ่มเวลาเป็น 60 นาที, เพิ่ม Blocker เป็น 5% หรือ Tween 20 เป็น 0.1%; หากใช้ phospho antibody ให้เปลี่ยนจากนมเป็น BSA |
| สัญญาณเป้าหมายอ่อนหรือหายไป | Blocker บดบัง epitope หรือ Blocking นานเกินไป | ลดเวลา Blocking เหลือ 30 นาที, ลด BSA เป็น 3% หรือเปลี่ยนเป็น Commercial blocker ที่องค์ประกอบอ่อนโยนขึ้น |
| เกิดแถบแบบไม่จำเพาะเจาะจง | แอนติบอดีเกิด cross-reactivity หรือการล้างไม่เพียงพอ | เพิ่มการล้าง 10 นาทีอีก 1 ครั้ง; เพิ่มการเจือจางแอนติบอดีและตรวจสอบความเข้ากันได้ของ Blocker กับชนิดของแอนติบอดี |
| เมมเบรนเป็นจุดๆ | บัฟเฟอร์นมไม่ได้กรองหรือมีตะกอนใน BSA | กรองบัฟเฟอร์ทั้งหมดผ่าน 0.45 ไมโครเมตรก่อนใช้; ละลาย BSA ให้สมบูรณ์ก่อนกรอง |
| ขอบเมมเบรนมืดหรือซีด | การบ่มแบบนิ่งหรือปริมาตรบัฟเฟอร์ไม่เพียงพอ | เขย่าถาดตลอดเวลา; ใช้ 0.2 ถึง 0.4 มิลลิลิตรต่อตารางเซนติเมตร |
| สัญญาณ HRP หายหรือไม่มีสัญญาณ | โซเดียมเอไซด์ยับยั้ง HRP | กำจัดเอไซด์ออกจากบัฟเฟอร์ทั้งหมด; เตรียมใหม่และทำซ้ำขั้นตอนแอนติบอดีทุติยภูมิ |
สรุปการเลือก Blocker
การเลือกนั้นตรงไปตรงมาเมื่อคุณจับคู่การทดลองเข้ากับคุณสมบัติทางเคมีของ Blocker ใช้ BSA สำหรับ phospho targets ใช้นมสำหรับงาน HRP หรือ AP ทั่วไปบนโปรตีนที่เสถียร และใช้สูตรสำเร็จรูปเมื่อต้องการฟลูออเรสเซนซ์หรือสัญญาณรบกวนต่ำ ตรวจสอบผลลัพธ์โดยการตัดเมมเบรนแบ่งครึ่งเพื่อเปรียบเทียบก่อนเริ่มการทดลองเต็มรูปแบบ
ปฏิบัติตามสูตรและปริมาณที่แนะนำในบทความนี้เพื่อเตรียมบัฟเฟอร์ให้ถูกต้องตั้งแต่ครั้งแรก เลือกแหล่งแอนติบอดีที่เชื่อถือได้และซับสเตรตตรวจวัดที่เข้ากันได้จากกลุ่มผลิตภัณฑ์ Immunodetection Reagents and Substrates ของ Merck เพื่อรักษาคุณภาพข้อมูลของคุณตั้งแต่ต้นจนจบ
คำถามที่พบบ่อย
ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค
ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express
เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ Western Blot จาก Merck, TCI, MedChemExpress (MCE) และ Elabscience และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE
English 
Thai