วิธีตรวจสอบ Apoptosis ด้วย Annexin V และ Flow Cytometry

การจำแนกเซลล์ตายว่าเป็นเซลล์ที่อยู่ในสภาวะ apoptosis ผิดพลาดเป็นหนึ่งในข้อผิดพลาดที่พบบ่อยที่สุดใน flow cytometry ซึ่งมักเกิดขึ้นก่อนที่คุณจะเปิดเครื่อง cytometer ด้วยซ้ำ การเก็บตัวอย่างที่รุนแรงเกินไปโดยใช้ EDTA การใช้บัฟเฟอร์ที่ไม่มีแคลเซียม หรือการปล่อยให้ตัวอย่างทิ้งไว้นานเกินไปก่อนนำไปวัดผล ล้วนลดประสิทธิภาพการจับของ Annexin V และทำให้ผลการตรวจวิเคราะห์ apoptosis detection flow cytometry ในระยะเริ่มต้นของคุณบิดเบือน คู่มือนี้จะแนะนำขั้นตอนการทำ apoptosis detection flow cytometry ด้วย Annexin V ตั้งแต่การเตรียมตัวอย่างจนถึงการตั้งค่า gating เพื่อให้คุณได้ผลลัพธ์ที่น่าเชื่อถือและจำแนกสัดส่วนเซลล์ในแต่ละระยะได้อย่างแม่นยำ

เหตุผลและช่วงเวลาที่ควรใช้ apoptosis detection flow cytometry ด้วย Annexin V

Annexin V จับกับ phosphatidylserine ซึ่งเป็นฟอสโฟลิพิดที่จะพลิกตัวออกสู่ด้านนอกของเยื่อหุ้มเซลล์ในระยะเริ่มต้นของ apoptosis เมื่อใช้ร่วมกับสีย้อมเพื่อตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์ (viability dye) การจับกันนี้จะทำให้คุณสามารถแยกเซลล์ที่มีชีวิต เซลล์ที่อยู่ในระยะเริ่มต้นของ apoptosis เซลล์ที่อยู่ในระยะท้ายของ apoptosis และเซลล์ที่ตายจากเนื้อตาย (necrosis) ออกจากกันได้ภายในหลอดเดียว ไม่มีวิธีตรวจวิเคราะห์ทั่วไปวิธีอื่นใดที่สามารถให้ความละเอียดในระดับเซลล์เดียวของกลุ่มเซลล์ทั้งสี่นี้ได้รวดเร็วเท่านี้

กระบวนการนี้เหมาะสำหรับการทดสอบแบบ dose-response, การศึกษาแบบ time-course และการควบคุมคุณภาพ (QC) ของสารที่ทำให้เซลล์ตาย โดยเป็นทางเลือกที่ถูกต้องเสมอเมื่อคุณต้องการแยกภาวะ early apoptosis ออกจากภาวะ necrosis ในประชากรเซลล์ผสม ซึ่งเป็นสิ่งที่การตรวจวิเคราะห์ความมีชีวิตของเซลล์ด้วย Cell Biology Assays บนเพลทไม่สามารถทำได้

เมื่อเปรียบเทียบกับวิธี caspase activity assays หรือ TUNEL วิธี Annexin V flow cytometry นั้นรวดเร็วกว่าและยังคงข้อมูลฟีโนไทป์เพียงพอที่จะสนับสนุนการตรวจวิเคราะห์แบบหลายพารามิเตอร์ จึงนิยมใช้อย่างแพร่หลายในด้านการรักษาด้วยเซลล์ (cell therapy), มะเร็งวิทยา และการทดสอบ QC บทความนี้ครอบคลุมการทำ apoptosis detection flow cytometry ด้วย Annexin V ตั้งแต่ต้นจนจบ ตั้งแต่การเตรียมตัวอย่างไปจนถึงการรายงานผล

อุปกรณ์ สารเคมี และตัวควบคุมที่จำเป็น

อุปกรณ์

คุณต้องมีเครื่อง flow cytometer ที่มีเลเซอร์ขนาด 488 nm และตัวตรวจวัด (detectors) สำหรับ FITC และ PI หรือ 7-AAD หากมีเลเซอร์สีแดงขนาด 640 nm เพิ่มเติม จะช่วยเพิ่มทางเลือกในการใช้ Annexin V APC ซึ่งช่วยลดการเหลื่อมกันของสเปกตรัม (spectral overlap) ในการตรวจวิเคราะห์แบบหลายพารามิเตอร์ เตรียมเครื่องหมุนเหวี่ยงแบบแช่เย็น (refrigerated centrifuge), เครื่อง vortex, ปิเปตที่ผ่านการสอบเทียบ และตัวกรองเซลล์ (cell strainers) ขนาด 40 µm

สารเคมี

ปฏิกิริยาการย้อมสีขึ้นอยู่กับส่วนประกอบสามอย่าง ได้แก่ Annexin V binding buffer ที่มี free Ca²⁺ ความเข้มข้นประมาณ 2.5 mM, คอนจูเกตฟลูออโรฟอร์ (fluorophore conjugate) ของ Annexin V ของคุณ (FITC หรือ APC เป็นที่นิยมที่สุด) และสีย้อมเพื่อตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์ เช่น PI, 7-AAD หรือ DAPI ควรใช้ PBS ที่ไม่มี EDTA สำหรับการล้างทุกขั้นตอน สำหรับตัวควบคุมเชิงบวก (positive control) ของ apoptosis การใช้ staurosporine หรือ camptothecin ที่ความเข้มข้น 1 µM เป็นเวลา 2 ถึง 4 ชั่วโมงได้ผลดีในเซลล์เกือบทุกประเภท

ชุดทดสอบ Annexin V Assay Kits จากกลุ่มผลิตภัณฑ์ของเราประกอบด้วย binding buffer, คอนจูเกต และสีย้อมที่พร้อมใช้งานในระบบเดียวที่ผ่านการตรวจสอบแล้ว ซึ่งช่วยขจัดปัญหาจากการเตรียมบัฟเฟอร์ที่มีแคลเซียมด้วยตัวเองและลดความแปรปรวนระหว่างลอต (lot-to-lot variation) สำหรับการย้อมสีร่วม (co-stain) กับตัวบ่งชี้บนพื้นผิวเซลล์ (surface marker) Antibodies สำหรับ Flow Cytometry ที่มีโคลนที่ผ่านการตรวจสอบแล้วจะรวมเข้ากับแผงการทดสอบแบบหลายพารามิเตอร์ได้อย่างราบรื่นโดยไม่เพิ่มค่าพื้นหลัง (background) ที่สูง

ตัวควบคุม (Controls)

อย่างน้อยที่สุดควรเตรียมหลอดทดลองดังนี้: หลอดที่ไม่ได้ย้อมสี, หลอดที่ย้อมเฉพาะ Annexin V, หลอดที่ย้อมเฉพาะสีย้อมตรวจสอบความมีชีวิต, ตัวควบคุมเชิงบวกของ apoptosis และตัวควบคุมเชิงลบ (healthy control) เพิ่มตัวควบคุมแบบ fluorescence-minus-one (FMO) หากคุณกำลังทำการทดสอบแบบหลายพารามิเตอร์ การใช้เม็ดบีดสำหรับชดเชยค่าแสง (compensation beads) ที่ตรงกับคอนจูเกตของคุณจะช่วยประหยัดเวลาและให้การตั้งค่าแรงดันไฟฟ้าที่สม่ำเสมอกว่าการชดเชยค่าแสงด้วยเซลล์ด้วยตนเอง

หมายเหตุการเก็บรักษา

เก็บคอนจูเกตทั้งหมดไว้ที่อุณหภูมิ 2 ถึง 8°C ในที่มืด หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ ตรวจสอบความเข้มข้นในการใช้งานที่แนะนำของแต่ละลอตก่อนใช้งาน เนื่องจากปริมาตรที่เหมาะสมอาจแตกต่างกันไปตามผู้ผลิตและลอตของคอนจูเกต

การเตรียมเซลล์และตัวควบคุมสำหรับการย้อมด้วย Annexin V

1. เก็บเซลล์ชนิดแขวนลอย (suspension cells) โดยการหมุนเหวี่ยงที่ 300 × g เป็นเวลา 5 นาที ที่ 4°C ค่อยๆ เทน้ำล้าง (supernatant) ออกโดยไม่รบกวนตะกอนเซลล์
2. สำหรับเซลล์ชนิดเกาะติด (adherent cells) ให้ใช้บัฟเฟอร์สำหรับแยกเซลล์ที่ปราศจากเอนไซม์ แทนที่จะใช้ trypsin-EDTA เนื่องจาก trypsin จะทำลายโปรตีนบนพื้นผิวเซลล์ และ EDTA จะจับกับแคลเซียม ทำให้การจับของ Annexin V ในขั้นตอนถัดไปบกพร่อง
3. ล้างตะกอนเซลล์หนึ่งครั้งด้วย PBS เย็นที่ไม่มี EDTA จากนั้นหมุนเหวี่ยงอีกครั้งที่ 300 × g เป็นเวลา 5 นาที ที่ 4°C
4. แขวนตะกอนเซลล์ใน Annexin V binding buffer เย็นที่มีแคลเซียม โดยใช้ความเข้มข้นเซลล์ประมาณ 1.0 ถึง 2.0 × 10⁵ เซลล์ ในปริมาตร 100 µL ต่อหลอด
5. กรองแต่ละตัวอย่างผ่านตัวกรองเซลล์ขนาด 40 µm ลงในหลอด cytometry ใหม่ เพื่อขจัดก้อนเซลล์ที่อาจทำให้เกิดการอุดตันและเพิ่มอัตราการเกิด doublet
6. เตรียมตัวควบคุมทั้งหมดควบคู่กันไป: หลอดที่ไม่ได้ย้อมสี, หลอดที่ย้อมเฉพาะ Annexin V, หลอดที่ย้อมเฉพาะสีย้อมตรวจสอบความมีชีวิต และตัวควบคุมเชิงบวกที่บ่มด้วย 1 µM staurosporine เป็นเวลา 2 ถึง 4 ชั่วโมงก่อนเก็บเกี่ยว
7. เก็บหลอดทั้งหมดไว้บนน้ำแข็งและใช้เวลาในการเตรียมให้สั้นที่สุด ยิ่งเซลล์ทิ้งไว้นานหลังการเก็บเกี่ยว เซลล์ที่อยู่ในระยะเริ่มต้นของ apoptosis จะเปลี่ยนเป็นระยะท้ายของ apoptosis มากขึ้นก่อนที่คุณจะนำไปวัดค่า

หากคุณกำลังย้อมสีร่วมกับตัวบ่งชี้บนพื้นผิวเซลล์ ให้ย้อมแอนติบอดีเหล่านั้นก่อนในบัฟเฟอร์ที่ไม่มีแคลเซียม จากนั้นล้าง และเปลี่ยนไปใช้ Annexin V binding buffer ที่มีแคลเซียมสำหรับขั้นตอน apoptosis ลำดับนี้จะรักษาทั้งการจับของแอนติบอดีและจลนพลศาสตร์การจับของ Annexin V น้ำยา Cell Health Analysis จาก Merck เหมาะอย่างยิ่งสำหรับ การคัดกรองความเป็นพิษต่อเซลล์ (cytotoxicity) และการตรวจสอบระดับโปรตีนเบื้องต้น เพื่อเป็นข้อมูลสำหรับการเลือกโดสและจุดเวลาที่เหมาะสมก่อนเริ่มการทดลองแบบเต็มรูปแบบ

การย้อมสีเซลล์ด้วย Annexin V และสีย้อมตรวจสอบความมีชีวิต

1. เติม Annexin V คอนจูเกต 5 µL ลงในเซลล์ที่แขวนลอยใน binding buffer ปริมาตร 100 µL ผสมให้เข้ากันเบาๆ ด้วยการดีดหลอด ห้ามใช้เครื่อง vortex
2. บ่มเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องในที่มืด การบ่มนานเกินไปจะเพิ่มค่าพื้นหลัง ส่วนการบ่มสั้นเกินไปจะลดสัญญาณในกลุ่มประชากรเซลล์ที่มี apoptosis อ่อนๆ
3. เติม PI หรือ 7-AAD 5 µL ลงในแต่ละหลอดโดยตรงโดยไม่ต้องล้าง หากใช้ DAPI ให้เติมทันทีก่อนการนำไปวัดผลด้วยเครื่อง cytometer แทนที่จะเติมในขั้นตอนนี้
4. หากคุณกำลังเติมแอนติบอดีเพื่อจำแนกฟีโนไทป์ ให้ทำการย้อมสีนั้นก่อนขั้นตอนที่ 1 ล้างหนึ่งครั้ง แล้วจึงดำเนินขั้นตอน Annexin V ในบัฟเฟอร์ที่มีแคลเซียม
5. เจือจางแต่ละหลอดที่ย้อมสีแล้วด้วย Annexin V binding buffer 400 µL เพื่อให้ปริมาตรรวมอยู่ที่ประมาณ 500 µL
6. เก็บหลอดทั้งหมดไว้บนน้ำแข็งและป้องกันแสง ควรวัดผลภายใน 60 นาทีหลังการย้อมสีเพื่อป้องกันไม่ให้ประชากรกลุ่ม apoptosis ระยะท้ายและ necrosis ขยายตัว

น้ำยา Live Cell Imaging Reagents จาก Merck รวมถึงสีย้อมนิวเคลียสและสีย้อมความมีชีวิตที่เข้ากันได้ ซึ่งทำงานขนานกันในขั้นตอนการตรวจสอบภาพถ่าย หากคุณกำลังทำ Fluorescence microscopy พร้อมกันกับ flow cytometry เพื่อการตรวจสอบซ้ำ การเลือกสีย้อมที่มีสเปกตรัมเข้ากันได้จากแพลตฟอร์มเดียวกันจะช่วยลดเวลาในการปรับแต่งใหม่

การวัดผล การทำ Gating และการหาปริมาณ Apoptosis ด้วย Flow Cytometry

การตั้งค่าเครื่อง Cytometer และการชดเชยค่าแสง (Compensation)

ใช้ตัวควบคุมที่ย้อมสีเดียว (single-stained controls) หรือเม็ดบีดชดเชยค่าแสงเพื่อกำหนดแรงดันไฟฟ้าของตัวตรวจวัดและสร้างเมทริกซ์การชดเชยก่อนที่จะรันตัวอย่างทดลอง ตรวจสอบว่าค่ามัธยฐานความเข้มข้นของฟลูออเรสเซนซ์ของกลุ่มประชากรเชิงลบ (negative population) ตรงกันในทุกตัวตรวจวัดหลังจากใช้การชดเชย การชดเชยที่บกพร่องในขั้นตอนนี้จะทำให้เซลล์เคลื่อนย้ายระหว่างควอดแรนท์ (quadrants) และทำให้เปอร์เซ็นต์ apoptosis ของคุณคลาดเคลื่อน

ตั้งค่าเกณฑ์ (threshold) บน FSC เพื่อคัดแยกสิ่งสกปรกออก ใช้กราฟ FSC-A เทียบกับ SSC-A เพื่อระบุประชากรเซลล์หลัก จากนั้นใช้ FSC-H เทียบกับ FSC-A เพื่อทำ gating เซลล์เดี่ยว (singlets) และตัด doublet ออก เก็บข้อมูลอย่างน้อย 10,000 เหตุการณ์ต่อเงื่อนไขเพื่อให้ได้สถิติที่มีความหมาย

การทำ Gating และการหาปริมาณประชากรเซลล์ Apoptosis

1. สร้างกราฟสัญญาณ Annexin V บนแกน x และสัญญาณสีย้อมความมีชีวิตบนแกน y
2. กำหนดขอบเขตควอดแรนท์โดยใช้ตัวควบคุมที่ไม่ได้ย้อมสีเพื่อจัดตำแหน่งขอบเขตด้านล่างซ้าย และใช้ตัวควบคุมที่ย้อมสีเดียวเพื่อตรวจสอบแต่ละแกนอย่างอิสระ
3. กำหนดกลุ่มประชากร: ล่างซ้าย (Annexin V ลบ, สีย้อมลบ) = เซลล์มีชีวิต; ล่างขวา (Annexin V บวก, สีย้อมลบ) = early apoptosis; บนขวา (บวกทั้งคู่) = late apoptosis หรือ secondary necrosis; บนซ้าย (Annexin V ลบ, สีย้อมบวก) = necrosis หรือเซลล์ที่เสียหายจากกลไกทางกายภาพ
4. บันทึกเปอร์เซ็นต์ของแต่ละควอดแรนท์ รวมค่า early และ late apoptosis เพื่อให้ได้ตัวเลข apoptosis รวม
5. บันทึกเทมเพลตการ gating และนำกลับมาใช้ซ้ำในทุกชุดการทดลอง บันทึกการตั้งค่าเครื่อง หมายเลขลอต และวันที่ทำการวัดผลในทุกรายงาน

สำหรับการตรวจสอบความถูกต้องแบบตั้งฉาก (orthogonal validation) ของระยะ apoptosis ชุดทดสอบ Caspase Assay Kits จะยืนยันการทำงานของ caspase-3/7 หรือ caspase-9 ซึ่งสัมพันธ์กับ early apoptosis ในควอดแรนท์ล่างขวาของ Annexin V ชุดทดสอบ TUNEL Assay Kits จะตรวจจับการแตกตัวของ DNA และยืนยันการตายของเซลล์ระยะท้ายในประชากรที่คุณเห็นในควอดแรนท์บนขวา การใช้วิธีใดวิธีหนึ่งควบคู่ไปกับ flow cytometry จะช่วยเพิ่มความมั่นใจในการกำหนดควอดแรนท์ของคุณ โดยเฉพาะเมื่อทำการคัดกรองสารประกอบใหม่ๆ

Antibodies สำหรับ Flow Cytometry ที่มีโคลนที่ผ่านการตรวจสอบจาก Merck ช่วยให้คุณสามารถเพิ่มตัวบ่งชี้ฟีโนไทป์ เช่น CD3, CD45 หรือเป้าหมายเฉพาะของสายพันธุ์เซลล์ ลงในหลอดเดียวกัน ทำให้ได้อัตราการเกิด apoptosis เฉพาะประชากรในการวัดเพียงครั้งเดียว สำหรับการตรวจสอบความมีชีวิตเพิ่มเติม ชุดทดสอบของ Merck สำหรับการวิเคราะห์เมตาโบไลต์และเอนไซม์ จะให้ข้อมูลเมตาโบลิซึมเสริมก่อนหรือหลังการรัน flow ของคุณ

เคล็ดลับการปรับปรุงและการป้องกันความปลอดภัย

Antibodies สำหรับ Flow Cytometry จาก Merck มีโคลนที่ผ่านการตรวจสอบพร้อมความจำเพาะในการจับที่ผ่านการทดสอบลอต การใช้ร่วมกับ Fc blocking ที่เหมาะสมจะช่วยลดการจับที่ไม่จำเพาะ (non-specific binding) ใน gate ของ Annexin V บวก ซึ่งช่วยให้ประชากร early apoptosis ของคุณสะอาดในแผงฟีโนไทป์ที่ซับซ้อน สำหรับ การวัดไซโตไคน์หรือโปรตีนที่หลั่งออกมาด้วยอิมมูโนแอสเสย์ ที่ทำควบคู่ไปกับแผง flow ของคุณ ควรประสานเวลาการทดลองเพื่อให้การเก็บเกี่ยวเซลล์และการเก็บน้ำล้างเกิดขึ้นจากเซลล์เลี้ยงเดียวกันในช่วงเวลาเดียวกัน

เพื่อความปลอดภัย: PI และ 7-AAD เป็นสีย้อมที่แทรกตัวเข้าใน DNA สวมถุงมือและอุปกรณ์ป้องกันดวงตาเมื่อใช้งาน กำจัดของเสียที่เป็นของเหลวที่มีสีย้อมตามกฎระเบียบของเสียเคมีของสถาบันของคุณ

การแก้ไขปัญหาทั่วไปเกี่ยวกับ Annexin V flow cytometry

ความน่าเชื่อถือของ Annexin V flow cytometry ขึ้นอยู่กับการจัดการแคลเซียม เวลาที่ควบคุมได้ และการใช้ตัวควบคุมที่ย้อมสีเดียวอย่างมีวินัย แก้ไขปัญหาแคลเซียมก่อนหากพบปัญหาเรื่องสัญญาณ เพราะนั่นช่วยแก้ปัญหาการจับตัวอ่อนได้เกือบทั้งหมด สำหรับข้อผิดพลาดในการชดเชยค่าแสงที่ยังคงอยู่ ให้สร้างเมทริกซ์ขึ้นใหม่ตั้งแต่ต้นโดยใช้ตารางเลเซอร์และตัวกรองที่แนะนำข้างต้น

คำถามที่พบบ่อย