วิธีสกัด DNA จากเซลล์พืช แบคทีเรีย และเนื้อเยื่อ: Protocol ฉบับปฏิบัติ

ความล้มเหลวในการทำ PCR ที่มีสาเหตุมาจากปนเปื้อนของพอลิแซ็กคาไรด์หรือฟีนอลตกค้าง ทำให้ตัวอย่างเสียหายและส่งผลให้การทดลองล่าช้า การทำลายสาย genomic DNA ในระหว่างการผสม หรือการข้ามขั้นตอนการทำความสะอาดที่ถูกต้อง ยิ่งทำให้ปัญหาทวีความรุนแรงขึ้น คู่มือฉบับนี้จะให้รายละเอียดบัฟเฟอร์ อุณหภูมิ และวิธีการทำความสะอาดที่แม่นยำ เพื่อให้คุณปฏิบัติตามวิธีสกัด DNA จากพืช (how to extract DNA from plant cells protocol) ตั้งแต่ขั้นตอนการสลายเซลล์ไปจนถึงการตรวจสอบคุณภาพ เพื่อให้ได้ DNA ที่พร้อมสำหรับ PCR ในความพยายามครั้งแรก

เมื่อใดที่ควรใช้วิธีนี้: เมทริกซ์, เวิร์กโฟลว์ และปริมาณผลผลิตที่คาดหวัง

ใช้โปรโตคอลนี้เมื่อมีความเสี่ยงสูงที่จะเกิด PCR inhibition จากพอลิแซ็กคาไรด์, โพลีฟีนอล หรือสารซักฟอกตกค้าง ครอบคลุมทั้งพืช, แบคทีเรียกลุ่มแกรมลบและแกรมบวก รวมถึงเนื้อเยื่อสัตว์ชนิดอ่อน

เวิร์กโฟลว์นี้สามารถนำไปใช้กับงาน PCR, qPCR, Sanger sequencing, barcoding และ genotyping ได้โดยตรง โดยสามารถปรับขนาดได้ตั้งแต่หลอดเดียวไปจนถึงแบบ 96-well พร้อมทั้งสร้างสมดุลระหว่างปริมาณที่ได้รับกับการกำจัดสารยับยั้งอย่างมีประสิทธิภาพ สำหรับภาพรวมเชิงลึกเกี่ยวกับหลักการของการสลายเซลล์และการกู้คืนกรดนิวคลีอิก โปรดดูคู่มือเรื่อง หลักการและขั้นตอนการสกัด DNA สำหรับงานวิจัยด้านอณูชีววิทยา

คู่มือฉบับนี้จะเปรียบเทียบระหว่างวิธี CTAB, SDS/Proteinase K และการใช้ซิลิกาคอลัมน์ เพื่อให้คุณสามารถเลือกวิธีที่เหมาะสมกับความซับซ้อนของเมทริกซ์ ปริมาณงาน และข้อจำกัดด้านความปลอดภัยได้

สิ่งที่คุณต้องเตรียม: อุปกรณ์, รีเอเจนต์ และอุปกรณ์ป้องกัน

อุปกรณ์

คุณจำเป็นต้องมีเครื่องเหวี่ยงหนีศูนย์กลาง (microcentrifuge) ที่ทำความเร็วได้ 12,000 ถึง 16,000 x g, เครื่องผสมสารแบบ Vortex ที่ปรับความเร็วต่ำได้ และ Heat block หรืออ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิที่ 37 °C และ 55 ถึง 65 °C สำหรับเนื้อเยื่อพืชที่แข็ง ให้ใช้เครื่องบดแบบลูกปัด (bead beater) หรือไนโตรเจนเหลวร่วมกับโกร่งบดสาร ใช้ทิปแบบมีฟิลเตอร์ตลอดการทำงาน และเปลี่ยนไปใช้ทิปรูกว้างเมื่อจัดการกับ DNA โมเลกุลใหญ่เพื่อป้องกันการตัดขาด

รีเอเจนต์หลัก

บัฟเฟอร์หลักสำหรับการสลายเซลล์พืชคือ CTAB buffer: 2% CTAB, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl เติม polyvinylpyrrolidone (PVP) ที่ 1 ถึง 2% สำหรับพืชที่มีสารกลุ่มฟีนอลสูง และเติม beta-mercaptoethanol (0.2%) สดใหม่ทันทีก่อนใช้งานเมื่อมีความเสี่ยงที่จะเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันจนเปลี่ยนเป็นสีน้ำตาล

สำหรับการสลายเซลล์แบคทีเรียและเนื้อเยื่อ ให้เตรียม lysozyme ที่ 1 mg/mL, สต็อก SDS 10%, Proteinase K ที่ 20 mg/mL และ RNase A ที่ 10 mg/mL ผลิตภัณฑ์กลุ่ม Nucleic Acid Purification จาก Sigma-Aldrich ครอบคลุมชุดคิทสกัด gDNA, คอลัมน์ทำความสะอาด และรีเอเจนต์แยกเฉพาะที่สามารถใช้ร่วมกับเวิร์กโฟลว์นี้ได้โดยไม่ต้องปรับสูตรบัฟเฟอร์ใหม่

รีเอเจนต์สำหรับการทำความสะอาดและตกตะกอน

สำหรับการสกัดด้วยตัวทำละลายอินทรีย์ ให้ใช้ chloroform:isoamyl alcohol (24:1) หรือ phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) สำหรับการใช้ซิลิกาคอลัมน์ ให้เตรียม Binding buffer ที่มีส่วนผสมของ guanidinium ตามคำแนะนำของชุดคิท สำหรับการตกตะกอน คุณต้องใช้ 100% isopropanol หรือ 100% ethanol, 70% ethanol สำหรับล้าง, 3 M sodium acetate pH 5.2 และ TE buffer หรือน้ำที่ปราศจากเอนไซม์นิวคลีเอสเพื่อใช้ในการละลาย

การเติม Spike-In Control

เติม lambda DNA 1 ng หลังการสลายเซลล์เพื่อใช้เป็นตัวควบคุมประสิทธิภาพการกู้คืน สิ่งนี้ช่วยให้คุณตรวจสอบประสิทธิภาพการสกัดได้อย่างสม่ำเสมอในทุกการรันโดยไม่เปลี่ยนองค์ประกอบทางเคมีของตัวอย่าง

การเตรียมและสลายเซลล์พืช, แบคทีเรีย และเนื้อเยื่อ

อุ่น CTAB buffer ที่ 65 °C ก่อนเริ่มใช้งาน เก็บตัวอย่างให้เย็นในระหว่างการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน (homogenisation) จากนั้นเปลี่ยนไปใช้อุณหภูมิฟักตัวเพื่อให้การสลายสมบูรณ์ ห้ามใช้ Vortex แรงๆ เมื่อบัฟเฟอร์สัมผัสกับตัวอย่างแล้ว

ตัวอย่างพืช

1. ชั่งใบอ่อน 50 ถึง 100 mg ใส่ลงในหลอด microcentrifuge ที่แช่เย็นไว้
2. เติมไนโตรเจนเหลวและบดให้ละเอียดทันทีด้วยโกร่งบดสารหรือเครื่องบดแบบลูกปัด อย่าปล่อยให้ตัวอย่างละลายก่อนเติมบัฟเฟอร์
3. ย้ายผงตัวอย่างไปใส่หลอดขนาด 1.5 mL ที่ปราศจากนิวคลีเอส เติม 600 ถึง 800 µL ของ CTAB buffer ที่อุ่นไว้ซึ่งมี PVP 1 ถึง 2% และ beta-mercaptoethanol 0.2%
4. ผสมโดยการพลิกหลอดไปมาเบาๆ 10 ถึง 15 ครั้ง หลีกเลี่ยงการเขย่า
5. ฟักตัวที่ 65 °C เป็นเวลา 10 ถึง 15 นาที โดยพลิกหลอดทุก 3 นาที จนกว่า lysate จะใส

ตะกอนแบคทีเรีย

1. เหวี่ยงตะกอนแบคทีเรีย 1 mL ที่เพาะเลี้ยงข้ามคืนที่ 10,000 x g เป็นเวลา 2 นาที เทส่วนใส (supernatant) ทิ้งให้หมด
2. ละลายตะกอนใน TE buffer 180 µL ที่มี lysozyme 1 mg/mL
3. ฟักตัวที่ 37 °C เป็นเวลา 30 นาทีโดยเขย่าเบาๆ สำหรับสายพันธุ์แกรมบวกที่มีผนังเพปทิโดไกลแคนหนา ให้เพิ่มเวลาเป็น 45 ถึง 60 นาที หรือเสริมด้วย mutanolysin
4. เติม 10% SDS 20 µL (ความเข้มข้นสุดท้าย 1%) และ Proteinase K 20 mg/mL จำนวน 20 µL (ความเข้มข้นสุดท้าย 0.2 mg/mL)
5. ฟักตัวที่ 55 °C เป็นเวลา 30 นาทีโดยผสมเบาๆ จน lysate ใสและมีความหนืด

เนื้อเยื่อสัตว์หรือพืชชนิดอ่อน

1. ตัดเนื้อเยื่อ 10 ถึง 25 mg บนพื้นผิวที่สะอาดและเย็นจัด ย้ายลงในหลอด 1.5 mL ทันที
2. เติม lysis buffer 400 ถึง 600 µL ที่มี 1% SDS บดให้เข้ากันด้วยแท่งพลาสติกหรือเครื่องบดแบบลูกปัดจนไม่เหลือชิ้นเนื้อ
3. เติม Proteinase K ให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 0.2 mg/mL
4. ฟักตัวที่ 56 °C เป็นเวลา 30 ถึง 60 นาที โดยผสมเป็นระยะจน lysate เป็นเนื้อเดียวกันและมีความหนืด

ผลิตภัณฑ์ Plant Biotechnology reagents ของ TCI ประกอบด้วยรีเอเจนต์สำหรับการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อและการเตรียมตัวอย่างที่รองรับการเตรียม lysis buffer สำหรับพืชที่มีความซับซ้อน ช่วยลดขั้นตอนการเตรียมสารก่อนถึงขั้นตอนการสกัด

การกำจัดโปรตีน, เศษเซลล์ และพอลิแซ็กคาไรด์

ขั้นตอนนี้จะแยก DNA ที่สะอาดออกจากโปรตีน, ลิพิด และคาร์โบไฮเดรต เลือกเส้นทางการทำความสะอาดตามความซับซ้อนของเมทริกซ์, อุปกรณ์ที่มี และความต้องการของปริมาณงาน

การสกัดด้วยสารอินทรีย์ CTAB (สำหรับ Lysate พืช)

1. ปล่อยให้ lysate เย็นลงที่อุณหภูมิห้อง หากความเข้มข้น NaCl ต่ำกว่า 0.7 M ให้ปรับค่าก่อนดำเนินการต่อ
2. เติม chloroform:isoamyl alcohol (24:1) ปริมาณเท่ากัน ปิดฝาและผสมโดยการพลิกหลอดเบาๆ 1 นาทีภายในตู้ดูดควัน
3. เหวี่ยงหนีศูนย์กลางที่ 12,000 x g เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
4. ย้ายเฉพาะชั้นบนที่เป็นสารละลายน้ำ (aqueous phase) ไปยังหลอดใหม่ ระวังอย่าไปโดนชั้นกลาง (interphase) สีขาว ซึ่งมีพอลิแซ็กคาไรด์และโปรตีนที่ถูกทำลายสภาพอยู่
5. ทำซ้ำการสกัดหากมีชั้นกลางหนาหรือสารละลายดูขุ่น

การสกัดด้วย SDS/Proteinase K (สำหรับแบคทีเรียหรือเนื้อเยื่อ)

1. เติม phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) หรือ chloroform:isoamyl alcohol (24:1) ปริมาณเท่ากันลงใน lysate
2. ผสมโดยการพลิกหลอดเบาๆ 1 นาที เหวี่ยงหนีศูนย์กลางที่ 12,000 x g เป็นเวลา 10 นาที
3. ย้ายชั้นบนอย่างระมัดระวังไปยังหลอดใหม่ ทำซ้ำหากมีการปนเปื้อนของโปรตีนสูง (แถบสีขาวที่รอยต่อระหว่างชั้น)

การทำความสะอาดด้วยซิลิกาคอลัมน์ (สำหรับตัวอย่างทุกประเภท)

1. ผสม lysate กับ Binding buffer (guanidinium-based) ในอัตราส่วน 1:1 ถึง 1:3 ตามคำแนะนำของชุดคิท
2. โหลดสารปริมาณสูงสุด 700 µL ต่อครั้งลงในคอลัมน์ เหวี่ยงที่ 8,000 x g เป็นเวลา 1 นาที เทน้ำที่ผ่านคอลัมน์ทิ้ง ทำซ้ำจนหมด lysate
3. ล้างเยื่อเมมเบรนสองครั้งด้วย Wash buffer ที่มีเอทานอล เหวี่ยง 1 นาทีระหว่างการล้างแต่ละครั้ง
4. เหวี่ยงแบบแห้ง (dry spin) ที่ความเร็วสูงสุดเป็นเวลา 1 นาที เพื่อกำจัดเอทานอลตกค้างก่อนการ elute

การตกตะกอน, การล้าง และการคืนสภาพ genomic DNA

การตกตะกอนจากชั้นสารละลายน้ำ

1. เติม 3 M sodium acetate pH 5.2 ปริมาณ 0.1 เท่าของปริมาตรสารละลาย แล้วผสมโดยการพลิกหลอด
2. เติม 100% isopropanol 0.6 เท่า หรือ 100% ethanol 2 เท่า ผสมเบาๆ จนเห็นสาย DNA เป็นตะกอนสีขาวหรือใยสีขาว
3. ฟักตัวที่อุณหภูมิห้อง 10 ถึง 30 นาที หรือที่ 4 °C นานถึง 1 ชั่วโมงสำหรับตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ำ
4. เหวี่ยงหนีศูนย์กลางที่ 12,000 ถึง 16,000 x g นาน 10 นาที เทส่วนใสทิ้งอย่างระมัดระวังโดยไม่รบกวนตะกอน
5. เติม 70% ethanol 1 mL เพื่อล้างตะกอน พลิกหลอดเบาๆ แล้วเหวี่ยงอีก 5 นาที ใช้ปิเปตดูดเอทานอลออกให้หมด

การทำให้แห้งและการละลาย

1. ผึ่งตะกอนให้แห้ง 5 ถึง 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องจนดูโปร่งแสง อย่าให้แห้งเกินไปเพราะตะกอนที่แข็งเป็นแก้วจะละลายยาก
2. ละลายใน TE buffer 50 ถึง 100 µL (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) หรือน้ำที่ปราศจากเอนไซม์นิวคลีเอส
3. หากต้องการกำจัด RNA ให้เติม RNase A ที่ 10 µg/mL และฟักตัวที่ 37 °C นาน 15 นาที ตามด้วยการตกตะกอนด้วยเอทานอลหรือผ่านซิลิกาคอลัมน์เพื่อกำจัดเอนไซม์

การ elute จากซิลิกาคอลัมน์

1. อุ่น Elution buffer หรือน้ำที่ปราศจากเอนไซม์ที่ 65 ถึง 70 °C
2. ใส่ลงในคอลัมน์โดยตรง 50 ถึง 100 µL ทิ้งไว้ 1 ถึง 5 นาที
3. เหวี่ยงเพื่อเก็บตัวอย่าง การทำซ้ำขั้นตอนการ elute อีกครั้งด้วย 30 ถึง 50 µL จะช่วยดึง DNA ที่เหลืออยู่ออกมาได้มากขึ้น

การตรวจสอบคุณภาพและหาปริมาณ DNA สำหรับ PCR

วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 260 nm เพื่อหาความเข้มข้น ค่า A260/A280 ที่ 1.8 ถึง 2.0 บ่งบอกว่ากำจัดโปรตีนได้เป็นที่น่าพอใจ ค่า A260/A230 ที่สูงกว่า 2.0 ยืนยันว่าไม่มีเกลือ, CTAB และสารกลุ่ม guanidinium ตกค้าง

การเตรียม DNA พืชด้วยวิธี CTAB บางครั้งให้ค่า A260/A230 อยู่ที่ 1.8 ถึง 2.0 แต่ยังสามารถเพิ่มจำนวนใน PCR ได้ดี หากกำจัดพอลิแซ็กคาไรด์ออกไปแล้วระหว่างการสกัด อย่าทิ้งตัวอย่างเพียงเพราะค่า A260/A230 อยู่ในระดับก้ำกึ่ง ให้ทดสอบทำ PCR ดูก่อน

สำหรับการตรวจสอบบนเจล ให้รัน 50 ถึง 100 ng บน agarose gel ความเข้มข้น 0.8 ถึง 1% genomic DNA ที่สมบูรณ์จะแสดงเป็นแถบเข้มอยู่ด้านบนของเจล การเห็นเป็น smear กระจายแสดงว่า DNA เสื่อมสภาพ และการปนเปื้อน RNA จะทำให้เห็นแถบสว่างที่น้ำหนักโมเลกุลต่ำ ซึ่งกำจัดได้ด้วย RNase A สำหรับการตั้งค่า PCR และการแก้ปัญหาเบื้องต้น โปรดดูคู่มือเรื่อง หลักการและขั้นตอน PCR สำหรับอณูชีววิทยา

สำหรับการทำ PCR ให้ใช้ template DNA 10 ถึง 100 ng ต่อปฏิกิริยา 25 µL ขึ้นอยู่กับความซับซ้อนของเป้าหมายและการออกแบบไพรเมอร์ หากค่าความบริสุทธิ์ต่ำกว่าเกณฑ์ ให้กลับไปตรวจสอบขั้นตอนการสลายเซลล์และการทำความสะอาดในวิธีสกัด DNA จากพืช (how to extract DNA from plant cells protocol) นี้ก่อนเริ่มการทดลองใหม่

การแก้ปัญหาและคำแนะนำเพื่อประสิทธิภาพสูงสุด

นำเคล็ดลับวิธีสกัด DNA จากพืช (how to extract DNA from plant cells protocol) นี้ไปใช้เมื่อค่าความบริสุทธิ์ไม่คงที่ สภาพของรีเอเจนต์เป็นสาเหตุที่พบบ่อยแต่ถูกมองข้าม Proteinase K มีความเสถียรที่ -20 °C รีเอเจนต์ที่เสื่อมสภาพจะทำให้เหลือโปรตีนปนเปื้อนและลดค่า A260/A280 RNase A สามารถทำลาย DNase ที่ปนเปื้อนได้โดยการให้ความร้อนที่ 100 °C นาน 15 นาที บัฟเฟอร์กลุ่ม guanidinium ต้องปิดฝาให้แน่นเพื่อป้องกันความชื้น CTAB buffer อาจเกิดการตกผลึกที่อุณหภูมิห้อง ให้อุ่นที่ 65 °C ก่อนใช้งาน

คำถามที่พบบ่อย