วิธีทำ Bradford Assay: โปรโตคอลและการสร้างเส้นมาตรฐาน BSA

ความแปรปรวนระหว่างเพลตในการวัดปริมาณโปรตีนมักมีสาเหตุมาจากปัญหาที่มองข้ามไป 2 ประการ ได้แก่ ความไม่เข้ากันของบัฟเฟอร์ระหว่างสารมาตรฐานกับตัวอย่าง และระยะเวลาในการบ่มก่อนอ่านค่า A595 ที่ไม่สม่ำเสมอ ข้อผิดพลาดทั้งสองนี้ส่งผลต่อความโค้งของเส้นมาตรฐานใน Bradford assay วิธีทำ ของคุณ และทำให้ค่าความเข้มข้นที่วัดได้อยู่นอกช่วงการวัดโดยที่คุณไม่ทันรู้ตัว คู่มือนี้จะให้แผนผัง Bradford assay protocol standard curve ที่ชัดเจน ตั้งแต่การเตรียมสารละลาย BSA เจือจางไปจนถึงขั้นตอนการคำนวณขั้นสุดท้าย เพื่อให้คุณสามารถทำตามขั้นตอนได้อย่างมั่นใจในทุกครั้ง

เมื่อใดควรเลือกใช้วิธี Bradford และสิ่งที่คุณจะได้รับจากวิธีนี้

Bradford assay เป็นเครื่องมือที่เหมาะสมเมื่อคุณต้องการวัดปริมาณโปรตีนอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิห้องโดยไม่จำเป็นต้องใช้เครื่องมือพิเศษ วิธีนี้วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 595 nm ซึ่งให้ผลลัพธ์ที่ดีกับเมทริกซ์ตัวอย่างส่วนใหญ่ที่พบในงานด้านเซลล์ชีววิทยาและชีวเคมี อีกทั้งยังทนต่อบัฟเฟอร์ทั่วไปที่ใช้ในห้องปฏิบัติการได้ดี ซึ่งถือเป็นส่วนหนึ่งของเวิร์กโฟลว์ Protein Purification & Analysis ของคุณ

คุณควรเลือกวิธีนี้เมื่อต้องการปรับค่าความเข้มข้น (normalization) อย่างรวดเร็วก่อนนำไปทำ SDS-PAGE, Western blot, การทดสอบการทำงานของเอนไซม์ หรือการรวมตัวอย่าง ช่วงความเป็นเส้นตรง (linear range) ของไมโครเพลตจะอยู่ที่ประมาณ 0.1 ถึง 1.0 mg/mL BSA โดยการตอบสนองอาจครอบคลุมไปถึง 1.5 mg/mL หากคุณใช้การฟิตเส้นโค้งแบบไม่เป็นเส้นตรงที่ผ่านการตรวจสอบโดย SOP ของห้องปฏิบัติการแล้ว

อย่างไรก็ตาม วิธีนี้มีข้อจำกัดที่ควรทราบ ตัวอย่างที่มีสารซักฟอก (detergent) หรือสารลดแรงตึงผิวความเข้มข้นสูงจะรบกวนการจับกับสีย้อมและลดการตอบสนองของสี หากตัวอย่างของคุณมีคุณสมบัติเช่นนั้น โปรดอ่านหัวข้อการเตรียมตัวอย่างก่อนเริ่มต้น

สิ่งที่คุณต้องเตรียม: อุปกรณ์, สารเคมี, และอุปกรณ์ป้องกันความปลอดภัย

อุปกรณ์และวัสดุสิ้นเปลือง

คุณจะต้องใช้เครื่องอ่านไมโครเพลต (microplate reader) หรือสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ (spectrophotometer) ที่ตั้งค่าไว้ที่ 595 nm สำหรับรูปแบบไมโครเพลต ให้ใช้เพลต 96 หลุมแบบก้นแบนชนิดใส สำหรับรูปแบบคิวเวต (cuvette) ให้ใช้คิวเวตที่มีระยะทางเดินแสง (pathlength) 1 cm การใช้ปิเปตที่สอบเทียบแล้วพร้อมหัวทิปชนิด low-retention จะช่วยลดการสูญเสียตัวอย่างปริมาณน้อยได้ดี

เตรียมเครื่องผสมสาร (vortex mixer), นาฬิกาจับเวลา, และเครื่องเขย่าเพลตให้พร้อม หลอด microfuge ช่วยให้การทำ serial dilution สะดวกขึ้น และ reagent reservoirs จะช่วยให้การจ่ายสารด้วยปิเปตหลายช่องง่ายขึ้น ควรใช้ฟิล์มปิดเพลตเพื่อป้องกันการระเหยระหว่างการบ่ม

สารเคมีและผลิตภัณฑ์

Bradford dye reagent จากกลุ่มผลิตภัณฑ์ Merck Colorimetric and Titrimetric Test Kits มีให้เลือกทั้งแบบพร้อมใช้และแบบเข้มข้น ช่วยลดข้อผิดพลาดในการเตรียมสารและประหยัดเวลา เก็บรักษาที่อุณหภูมิ 2 ถึง 8°C ในที่มืด และปรับให้เป็นอุณหภูมิห้องก่อนใช้งาน

สำหรับสารมาตรฐาน BSA สามารถใช้จากกลุ่มผลิตภัณฑ์ Merck Albumins and Transport Proteins การใช้ BSA ความบริสุทธิ์สูงที่มีการรับรองปริมาณโปรตีนจะช่วยให้คุณสร้าง Bradford assay protocol standard curve ที่เชื่อถือได้และทำซ้ำได้โดยไม่ต้องกังวลถึงส่วนประกอบของสารมาตรฐาน ให้ละลายสารจนได้ความเข้มข้น 2.0 mg/mL ในบัฟเฟอร์เดียวกับตัวอย่างก่อนใช้

หากตัวอย่างของคุณมีส่วนประกอบของ SDS, Triton X-100 หรือสารลดแรงตึงผิวอื่นๆ ควรใช้ขั้นตอนการกำจัดเกลือหรือกำจัดสารซักฟอกโดยใช้ชุดคิท Protein Sample Prep การเตรียมเมทริกซ์ให้พร้อมก่อนทำการวิเคราะห์จะรวดเร็วกว่าการทำซ้ำเมื่อผลลัพธ์ล้มเหลว

ความปลอดภัย

สวมเสื้อกาวน์ ถุงมือไนไตรล์ และอุปกรณ์ป้องกันดวงตา สีย้อม Coomassie Brilliant Blue สามารถทิ้งรอยเปื้อนบนผิวหนัง โต๊ะปฏิบัติการ และพลาสติกได้ หากเกิดการหก ให้เช็ดทำความสะอาดทันทีด้วยผ้าชุบน้ำและกำจัดวัสดุที่เปื้อนตามกฎระเบียบของสถานที่

สร้าง Bradford assay protocol standard curve ด้วย BSA

การเตรียม BSA สต็อกและซีรีส์การเจือจาง

เริ่มต้นด้วยสต็อก BSA ความเข้มข้น 2.0 mg/mL ที่เตรียมในบัฟเฟอร์เดียวกันกับตัวอย่างของคุณ หากใช้ BSA ที่ผ่านการรับรองจากกลุ่มผลิตภัณฑ์ Merck Albumins and Transport Proteins ให้ค่อยๆ พลิกหลอดเพื่อละลายให้หมด หลีกเลี่ยงการใช้ vortex อย่างรุนแรง ซึ่งอาจทำให้ BSA เสียสภาพและเกิดฟองอากาศที่ส่งผลต่อค่าการดูดกลืนแสง

วางแผนการสร้างกราฟ 7 จุดรวมถึงค่า Blank ตารางด้านล่างแสดงความเข้มข้นเป้าหมายและปริมาตรการปิเปตสำหรับการทำ 1:2 serial dilution เริ่มต้นจากสต็อก 2.0 mg/mL โดยใช้ปริมาตรรวม 200 µL ต่อหลอด

รูปแบบเพลตและปริมาตรปฏิกิริยา

ทำการทดสอบสารมาตรฐานแต่ละจุดซ้ำ 2 หรือ 3 ครั้งในแถวแรกของเพลต และรวมการทดสอบ QC มาตรฐานที่ความเข้มข้นกลาง (0.250 mg/mL เตรียมแยกจากซีรีส์หลัก) ซ้ำ 2 ครั้งในทุกเพลตเพื่อติดตามความคลาดเคลื่อนที่อาจเกิดขึ้นในแต่ละวัน

สำหรับไมโครเพลต: เติม Bradford reagent 200 µL ลงในแต่ละหลุมก่อน จากนั้นเติมสารมาตรฐานหรือตัวอย่าง 5 ถึง 10 µL สำหรับคิวเวต: ผสม reagent 1.0 mL กับสารมาตรฐาน 50 µL ในคิวเวตขนาด 1 cm

การบ่มและการอ่านค่า

1. เตรียมสารมาตรฐานที่เจือจางแล้วทั้งหมดในหลอด microfuge ผสมโดยการปิเปตอย่างเบามือเพื่อลดการเกิดฟอง
2. จ่าย Bradford reagent 200 µL ลงในแต่ละหลุมของไมโครเพลตด้วยปิเปตหลายช่อง
3. เติมสารมาตรฐาน 5 ถึง 10 µL ลงในหลุมที่กำหนด ผสมโดยการเคาะเบาๆ หรือเขย่าเพลตด้วยความเร็วต่ำเป็นเวลา 5 วินาที
4. บ่มเป็นเวลา 5 ถึง 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง โดยหลีกเลี่ยงแสงสว่างโดยตรง
5. อ่านค่า A595 ที่จุดเวลาที่กำหนด เช่น 10 นาทีพอดีหลังเติม reagent ให้ครบทั้งเพลต
6. หักลบค่า A595 ของ Blank ออกจากค่าสารมาตรฐานทั้งหมดก่อนนำไปพล็อต
7. ฟิตแบบ linear regression กับข้อมูลในช่วงต่ำถึงกลาง หากพบความโค้งที่ระดับ 1.0 mg/mL ขึ้นไป ให้จำกัดช่วงการฟิตหรือใช้สมการพหุนามอันดับสองที่ได้รับการรับรอง

เตรียมตัวอย่างและสารเจือจางให้เข้ากับ Bradford reagent

หากตัวอย่างของคุณมีสารซักฟอกหรือสาร chaotropic agent รุนแรง ให้ทำความสะอาดตัวอย่างก่อนด้วยชุดคิท Protein Purification & Analysis หรือเจือจางตัวอย่างอย่างน้อย 10 เท่าเพื่อลดสารรบกวนให้ต่ำกว่าเกณฑ์ ตรวจสอบการฟื้นตัว (recovery) โดยการเติมโปรตีนควบคุมภายในที่คุณทราบความเข้มข้นลงในตัวอย่างส่วนหนึ่งแล้ววัดเปรียบเทียบค่าที่คาดหวังกับค่าที่วัดได้จริง

เจือจางตัวอย่างที่ไม่ทราบค่าทั้งหมดในบัฟเฟอร์เดียวกับที่ใช้ทำมาตรฐาน BSA พยายามให้ค่า A595 ที่วัดได้อยู่กึ่งกลางของช่วงมาตรฐาน ความเข้มข้นที่ขอบของกราฟจะมีความไม่แน่นอนสูงที่สุด

ใช้ตัวเลขเหล่านี้เป็นจุดเริ่มต้นในการทดลอง:

• Cell lysates: 1:10, 1:20, 1:40
• Purified proteins: 1:50 ถึง 1:200
• Column fractions: วัดแบบไม่เจือจางก่อน แล้วค่อยเจือจางตามสัญญาณที่ได้รับ

เตรียมตัวอย่าง Blank ที่ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ตัวอย่างแต่ไม่มีโปรตีน ใช้ Blank นี้สำหรับการหักลบพื้นหลังสำหรับทุกหลุมตัวอย่าง สำหรับ lysate ที่มีความขุ่นหรือมีสี ให้ทำให้ใสด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วที่เหมาะสมกับประเภทตัวอย่าง แล้วใช้ส่วนใสที่แยกได้ ระวังสีที่หลงเหลืออยู่ซึ่งอาจเปลี่ยนค่า baseline และต้องหักลบค่านี้ออกด้วย

ผสมแต่ละตัวอย่างที่เจือจางแล้วเบาๆ จากนั้นปั่นเหวี่ยงสั้นๆ เพื่อกำจัดฟองอากาศ เก็บตัวอย่างไว้ที่อุณหภูมิห้องเพื่อให้ตรงกับสภาวะอุณหภูมิของสารมาตรฐานระหว่างการบ่ม

ทดสอบและคำนวณความเข้มข้น

การทดสอบ

1. จ่าย Bradford reagent ลงในทุกหลุม รวมถึงหลุมมาตรฐาน, Blank, และตัวอย่าง
2. เติมตัวอย่างที่เจือจางแล้ว 5 ถึง 10 µL ลงในหลุมที่กำหนด สำหรับคิวเวต ให้ผสม reagent 1.0 mL กับตัวอย่าง 50 µL
3. ผสมโดยการเคาะเบาๆ หรือเขย่าเพลต 5 วินาที หลีกเลี่ยงการเกิดฟอง
4. บ่ม 5 ถึง 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ตามเวลาเดียวกับที่คุณบ่มสารมาตรฐาน
5. อ่านค่าที่ 595 nm ปรับแก้ด้วยค่า pathlength หากเครื่องอ่านรองรับ บันทึกเวลาที่อ่านค่า

การใช้ Bradford reagent kit จากกลุ่มผลิตภัณฑ์ Merck Colorimetric and Titrimetric Test Kits ช่วยให้คุณมั่นใจได้ว่าความเข้มข้นของสีย้อมมีความสม่ำเสมอในทุก Lot ซึ่งทำให้ Slope ของเส้นมาตรฐานเปรียบเทียบกันได้ในทุกการทดลอง การใช้สีย้อมที่มาจากคนละ Lot มักเป็นสาเหตุของผลลัพธ์ที่แกว่งไปมาโดยไม่ทราบสาเหตุ

การคำนวณความเข้มข้นของตัวอย่างที่ไม่ทราบค่า

หักลบค่า Blank A595 ออกจากค่าที่วัดได้ทั้งหมด หาค่าเฉลี่ยของค่าที่วัดซ้ำ ใช้สมการ linear regression จากกราฟมาตรฐานเพื่อคำนวณความเข้มข้น:

C (mg/mL) = (A595,corrected − intercept) ÷ slope

คูณด้วย Dilution factor เพื่อให้ได้ความเข้มข้นในตัวอย่างเดิม รายงานผลเป็น mg/mL หรือ µg/µL ตามที่ต้องการ

ตารางด้านล่างแสดงพารามิเตอร์สำคัญที่ต้องบันทึกในทุกการทดลอง ในส่วนของเอนไซม์และเมแทบอไลต์ การบันทึกข้อมูลลักษณะนี้ก็ใช้กับ Merck assay kits for metabolite and enzyme analysis เช่นกัน ซึ่งถือเป็นนิสัยที่ดีในการทำห้องปฏิบัติการ

หากผลลัพธ์ QC มาตรฐานอยู่นอกช่วง ±10% การทดลองนั้นจะถือว่าไม่ผ่านเกณฑ์ ให้ทำใหม่หลังจากระบุและแก้ไขสาเหตุของความแปรปรวนก่อนที่จะรายงานผล

เคล็ดลับและข้อควรระวังเพื่อความแม่นยำและการทำซ้ำได้

สำหรับตัวอย่างที่มีสารซักฟอกสูง ให้ตรวจสอบความทนทานที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่คุณจะใช้จริง ทำการทดสอบ spike recovery ก่อนทดลองกับตัวอย่างจริงทั้งหมด หากเปอร์เซ็นต์การฟื้นตัวต่ำกว่า 90% ให้พิจารณาใช้ชุด Protein Sample Prep เพื่อกำจัดสารซักฟอกและทำการทดสอบซ้ำ

โปรตีนที่มีองค์ประกอบกรดอะมิโนต่างจาก BSA อย่างมาก โดยเฉพาะที่มีอาร์จินีน (arginine) ต่ำ อาจแสดงผลลัพธ์ที่เบี่ยงเบนไปจากมาตรฐาน BSA ในกรณีดังกล่าว ให้ทำกราฟมาตรฐานคู่ขนานด้วยโปรตีนที่ใกล้เคียงกับตัวอย่าง หรือใช้ค่าแก้ไขที่ได้จากการทดลองจริง

บันทึกตำแหน่งบนเพลต, หมายเลข Lot ของ Reagent, เวลาบ่ม, และสมการที่ได้ลงในสมุดบันทึกปฏิบัติการหรือระบบ LIMS ของคุณ ข้อมูลนี้จะกลายเป็นเส้นทางการตรวจสอบ (audit trail) ของคุณหากผลการวิเคราะห์ถูกตั้งคำถามภายหลัง

การแก้ไขปัญหาทั่วไปของ Bradford Assay

สรุป: การวัดปริมาณโปรตีนที่เชื่อถือได้ในทุกการวิเคราะห์

การเลือกใช้บัฟเฟอร์ให้ตรงกับสารมาตรฐาน BSA, การสร้างซีรีส์การเจือจาง 7 จุด และการอ่านค่าในช่วงเวลาที่กำหนด คือ 3 ขั้นตอนสำคัญที่จะเปลี่ยน Bradford assay จากการประมาณการทั่วไปให้เป็นการวัดที่ตรวจสอบย้อนกลับได้ ให้ทำตามขั้นตอนเดิมอย่างสม่ำเสมอและติดตามมาตรฐาน QC ระดับกลางเพื่อยืนยันว่าการทดลองของคุณดำเนินไปตามเกณฑ์

หากตัวอย่างของคุณต้องได้รับการทำความสะอาดก่อนวิเคราะห์ ให้จัดการเป็นขั้นตอนแยกต่างหาก แทนที่จะหวังว่าการเจือจางเพียงอย่างเดียวจะช่วยลดการรบกวนได้ การทำ cleanup เพียงหนึ่งครั้งด้วยชุดคิทที่มีประสิทธิภาพจะประหยัดเวลาได้มากกว่าการแก้ไขปัญหาหลังจากผลลัพธ์ล้มเหลว

คำถามที่พบบ่อย