วิธีเตรียม Competent Cells ด้วย Calcium Chloride: Protocol ฉบับปฏิบัติ

จำนวน Colony ที่น้อยเกินไปหลังการทำ Transformation มักมีสาเหตุมาจากรายละเอียดที่มองข้ามไป เช่น เซลล์ที่มีอุณหภูมิสูงเกิน 4°C ระหว่างเตรียม หรือการเก็บเซลล์ในช่วงท้ายของ log phase เกินเวลา วิธีเตรียม competent cells ด้วย CaCl2 เป็นวิธีที่ง่ายและใช้เครื่องมือไม่มาก แต่ต้องการการควบคุมอุณหภูมิที่เคร่งครัดและเวลาที่แม่นยำในทุกขั้นตอน คู่มือนี้จะให้พารามิเตอร์ที่แน่นอน ขั้นตอนการทำ QC Transformation และตารางแก้ไขปัญหาเพื่อให้คุณสามารถผลิตและตรวจสอบความเชื่อมั่นของเซลล์แต่ละชุดได้อย่างมั่นใจ

ทำไมและเมื่อไหร่ที่ควรใช้วิธีเตรียม competent cells ด้วย CaCl2

วิธี CaCl2 เป็นตัวเลือกมาตรฐานสำหรับการโคลนนิ่งพลาสมิดทั่วไป, ligation transformation และการคัดเลือกแบบ blue-white screening โดยใช้เพียงตู้แช่เย็น, อ่างน้ำร้อน 42°C และสารเคมีมาตรฐานในห้องแล็บเท่านั้น โดยไม่จำเป็นต้องใช้เครื่อง electroporator

ประสิทธิภาพในการทำ Transformation โดยทั่วไปจะอยู่ในช่วง 1 × 10⁵ ถึง 1 × 10⁷ cfu ต่อไมโครกรัมของ pUC19 ซึ่งครอบคลุมงานโคลนนิ่งส่วนใหญ่ รวมถึงการทำ subcloning, การเตรียมสำหรับการทำ site-directed mutagenesis และการทำ library amplification จาก insert ที่มีขนาดปานกลาง

หากการทดลองของคุณเกี่ยวข้องกับการใช้ DNA ปริมาณน้อยมาก (ต่ำกว่า 1 pg), พลาสมิดที่มีขนาดใหญ่กว่า 10 kb หรือการทำ library ที่ต้องการความหลากหลายสูง (diversity) ควรพิจารณาใช้วิธี Inoue RbCl หรือการทำ electroporation แทน สำหรับมุมมองที่กว้างขึ้นเกี่ยวกับ โครงสร้างของขั้นตอนการโคลนนิ่งและการนำ transformation เข้าไปใช้ในกระบวนการ บริบทดังกล่าวจะช่วยให้คุณเลือกวิธีที่เหมาะสมกับเป้าหมายปลายทางได้ดียิ่งขึ้น

สิ่งที่คุณต้องเตรียม: อุปกรณ์, สารเคมี และอุปกรณ์ป้องกัน

รายการอุปกรณ์

• ตู้บ่มเชื้อแบบเขย่า (Shaking incubator) ที่ 37°C, 200 ถึง 250 rpm สำหรับการเลี้ยงเชื้อ
• เครื่อง Spectrophotometer สำหรับติดตามค่า OD₆₀₀ (วัดทุกๆ 20 ถึง 30 นาที)
• เครื่องเหวี่ยงหนีศูนย์แบบแช่เย็น (Refrigerated centrifuge) ที่มีหัวเหวี่ยงแบบ swinging-bucket ซึ่งสามารถทำแรงเหวี่ยงได้ 3000 × g ที่ 4°C
• อ่างน้ำร้อน (Water bath) 42°C สำหรับทำ heat shock
• ถังน้ำแข็ง (Ice bucket) พร้อมน้ำแข็งบดที่เพียงพอสำหรับใส่หลอดและขวด
• เครื่อง Microcentrifuge สำหรับขั้นตอนการแบ่งสาร
• ตู้แช่แข็ง -80°C (ที่ไม่ใช่แบบละลายน้ำแข็งอัตโนมัติ) สำหรับเก็บตัวอย่างระยะยาว
• หลอด conical ขนาด 15 mL และ 50 mL, หลอด microtube และทิปปิเปตที่แช่เย็นไว้ล่วงหน้า

รายการสารเคมี

• LB Broth (Miller) หรืออาหารเลี้ยงเชื้อ SOB สำหรับการเพิ่มจำนวนเชื้อ Sigma-Aldrich LB Broth (Miller) L3522 เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดผงที่ได้รับความนิยมสูงและมีสารอาหารครบถ้วน เหมาะสำหรับเชื้อ E. coli มาตรฐาน การใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่ผลิตอย่างสม่ำเสมอจะช่วยลดความแปรปรวนระหว่าง Lot ซึ่งเป็นปัจจัยรบกวนผลลัพธ์ของความสามารถในการรับ DNA ของเซลล์ สำหรับรูปแบบของเหลวพร้อมใช้ L2542 จะช่วยประหยัดเวลาในการเตรียมสำหรับวันที่งานหนัก
• 0.1 M CaCl2 ปลอดเชื้อ ที่แช่เย็นจนจัด และผ่านการกรองฆ่าเชื้อผ่านเมมเบรน 0.22 µm
• 100% Glycerol ปลอดเชื้อ สำหรับขั้นตอนการ resuspend เพื่อป้องกันเซลล์จากการแช่แข็ง
• อาหารเลี้ยงเชื้อ SOC สำหรับใช้พักเซลล์หลังการทำ heat shock Sigma-Aldrich SOC Medium S1797 ได้รับการปรับสูตรมาเพื่อการฟื้นตัวของเซลล์โดยเฉพาะ และช่วยลดเวลาที่คุณต้องเสียไปกับการแก้ปัญหาเรื่องการเติมกลูโคส SOC ที่เตรียมสำเร็จรูปช่วยลดปัญหาการฟื้นตัวของเซลล์ที่ทำได้ไม่ดี
• LB Agar plates ผสมยาปฏิชีวนะ: เช่น Sigma-Aldrich LB Agar Ampicillin-100 Plates L5667 (100 µg/mL ampicillin) หรือ LB Agar Kanamycin-50 Plates L0543 ตามยีนดื้อยาที่ต้องการคัดเลือก
• pUC19 control plasmid (หรือเทียบเท่า) ที่ความเข้มข้น 10 pg/µL ในน้ำปราศจาก Nuclease สำหรับคำนวณประสิทธิภาพการทำงานของชุดเตรียมเซลล์
• น้ำปลอดเชื้อที่ปราศจาก Nuclease สำหรับเจือจาง DNA

อุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล

• เสื้อกาวน์ ถุงมือ และแว่นตานิรภัยตลอดการทำงาน
• สารละลาย CaCl2 จะเกิดความร้อนเมื่อละลายน้ำ โปรดเตรียมและใช้งานด้วยความระมัดระวัง
• ทำความสะอาดทันทีหากทำหก: CaCl2 มีคุณสมบัติดูดความชื้นและทิ้งคราบไว้บนพื้นผิว

การเลี้ยงเชื้อสดให้ถึงระยะ Mid-Log Phase

เริ่มต้นด้วยเซลล์สดจากเพลทที่เพิ่งเขี่ยเชื้อ ระยะการเจริญเติบโตในตอนเก็บเกี่ยวจะเป็นตัวกำหนดโดยตรงว่าเซลล์จะรับ DNA เข้าไปได้มากน้อยเพียงใดหลังการทำ CaCl2

1. เขี่ยเชื้อ (Streak) สายพันธุ์ที่ต้องการโคลนนิ่ง (DH5alpha, TOP10 หรือเทียบเท่า) ลงบน LB agar โดยใช้เพลทที่อายุน้อยกว่า 2 สัปดาห์และไม่มีการคัดเลือกพลาสมิด
2. เลือก (Pick) โคโลนีเดี่ยวที่แยกออกมาได้ดีมาเลี้ยงใน 5 mL LB Broth บ่มข้ามคืนที่ 37°C, 200 ถึง 250 rpm เป็นเวลา 12 ถึง 16 ชั่วโมง
3. เจือจาง (Dilute) เชื้อที่บ่มข้ามคืนในอัตราส่วน 1:100 ลงใน 50 ถึง 100 mL LB ในขวดรูปชมพู่แบบมีร่อง (baffled flask) ขวดแบบมีร่องจะช่วยเพิ่มการถ่ายเทอากาศและทำให้เชื้อโตเร็วและสม่ำเสมอมากขึ้น
4. บ่ม (Incubate) ที่ 37°C, 200 ถึง 250 rpm เริ่มวัดค่า OD₆₀₀ ที่ 60 นาที แล้ววัดซ้ำทุก 20 ถึง 30 นาที
5. เก็บเกี่ยว (Harvest) เมื่อค่า OD₆₀₀ ถึง 0.35 ถึง 0.45 หากเก็บเกี่ยวที่ค่าสูงกว่า 0.5 เซลล์จะมีความสามารถในการรับ DNA ลดลงและเสี่ยงต่อการแตก (lysis) ระหว่างขั้นตอนการล้างด้วย CaCl2 อย่าปล่อยให้เชื้อโตเกินค่านี้

ตารางด้านล่างสรุปพารามิเตอร์การเจริญเติบโตที่สำคัญ การรักษาค่าเหล่านี้จะช่วยลดปัญหาความแปรปรวนในวิธีเตรียม competent cells ด้วย CaCl2 ได้

การทำให้เย็น เก็บเกี่ยว และล้างด้วย CaCl2 ที่เย็นจัด

ส่วนนี้คือช่วงที่ประสิทธิภาพการทำ Transformation มักสูญเสียไป อุณหภูมิที่เย็นและการจัดการอย่างนุ่มนวลไม่ใช่เรื่องเล่นๆ แต่เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับ CaCl2 ในการปรับสภาพเยื่อหุ้มเซลล์ชั้นนอก

1. เตรียมให้เย็น (Pre-chill) หัวเหวี่ยง centrifuge, อะแดปเตอร์, หลอด conical 50 mL และสารละลาย 0.1 M CaCl2 บนน้ำแข็งอย่างน้อย 30 นาทีก่อนใช้งาน
2. ย้าย (Transfer) ขวดเชื้อจากตู้บ่มมาวางบนน้ำแข็งทันที เขย่าเบาๆ เพื่อให้เย็นลง บ่มบนน้ำแข็งนาน 10 ถึง 15 นาที ขั้นตอนนี้จะหยุดการเจริญเติบโตและเริ่มปรับสภาพเยื่อหุ้มเซลล์
3. เหวี่ยง (Centrifuge) ที่ 4°C, 3000 × g, เป็นเวลา 10 นาที โดยใช้หัวเหวี่ยงที่แช่เย็นไว้
4. เทส่วนใสทิ้ง (Decant) ทันทีและให้หมด คว่ำหลอดบนกระดาษซับสะอาดประมาณ 30 วินาทีเพื่อกำจัดน้ำเลี้ยงเชื้อที่เหลืออยู่ เพราะคราบ Mg2+ จาก LB อาจรบกวนการจับของ CaCl2
5. แขวนตะกอน (Resuspend) เซลล์ใน 0.1 M CaCl2 ที่เย็นจัด โดยใช้ปริมาตรประมาณ 0.4 เท่าของปริมาตรเดิม (เช่น เชื้อ 50 mL ให้ใช้ CaCl2 20 mL) ผสมโดยการหมุนเบาๆ หรือดูดขึ้นลงอย่างช้าๆ ห้าม Vortex
6. บ่ม (Incubate) บนน้ำแข็งนาน 20 ถึง 30 นาที เพื่อให้ไอออน Ca2+ จับกับชั้น lipopolysaccharide ของเยื่อหุ้มเซลล์ชั้นนอกและสร้างรูพรุนชั่วคราว
7. เหวี่ยง (Centrifuge) อีกครั้งที่ 4°C, 3000 × g, เป็นเวลา 10 นาที
8. ทิ้งส่วนใส (Discard) อย่างระมัดระวัง ตะกอนเซลล์ช่วงนี้จะเปราะบางมาก อย่ารบกวนตะกอนขณะเทของเหลวออก

การ Resuspend ครั้งสุดท้าย, การแบ่งหลอด, การแช่แข็ง และการตรวจสอบ QC

การ Resuspend และแบ่ง aliquot

1. เตรียม 0.1 M CaCl2 ที่เย็นจัดผสม 15% Glycerol ปลอดเชื้อ
2. Resuspend ตะกอนเซลล์ครั้งสุดท้ายในสารละลาย CaCl2-glycerol นี้ ใช้ปริมาตรประมาณ 1 mL ต่อปริมาตรเชื้อเดิม 25 mL (เช่น เชื้อ 50 mL ใช้ 2 mL) ผสมโดยการหมุนเบาๆ
3. บ่ม บนน้ำแข็ง 30 นาที
4. แบ่ง (Aliquot) ลงในหลอด microtube ที่ผ่านการฆ่าเชื้อและแช่เย็นแล้วหลอดละ 50 µL ทำงานด้วยความรวดเร็วเพื่อให้เซลล์เย็นอยู่เสมอ
5. แช่แข็งทันที (Snap freeze) แต่ละหลอดในไนโตรเจนเหลวหรืออ่างน้ำแข็งแห้ง-เอทานอล เป็นเวลา 5 นาที การแช่แข็งช้าจะทำให้เซลล์ตายได้มาก
6. ย้าย เก็บที่ -80°C ทันที ระบุสายพันธุ์ วันที่ และหมายเลข Batch หลีกเลี่ยงตู้แช่แข็งแบบละลายน้ำแข็งอัตโนมัติ (frost-free) เพราะรอบการละลายน้ำแข็งจะทำลายความสามารถในการรับ DNA ของเซลล์

การทำ QC Transformation และคำนวณประสิทธิภาพ

1. ละลาย (Thaw) เซลล์ 1 หลอด (50 µL) บนน้ำแข็ง 5 นาที อย่าละลายที่อุณหภูมิห้อง
2. เติม 1 ถึง 10 pg ของ pUC19 ในน้ำ 2 ถึง 5 µL ดีดหลอดเบาๆ เพื่อผสม อย่าใช้ปิเปตผสมแรงๆ
3. บ่ม บนน้ำแข็ง 30 นาที
4. ทำ Heat shock ที่ 42°C เป็นเวลา 45 วินาที โดยใช้อ่างน้ำร้อนที่ผ่านการสอบเทียบ
5. ย้าย กลับลงน้ำแข็งทันทีนาน 2 นาที
6. เติม 450 µL SOC (บ่มอุ่นที่ 37°C) สูตรพิเศษของ Sigma-Aldrich SOC Medium S1797 รองรับการฟื้นตัวที่รวดเร็วโดยไม่ต้องเติมกลูโคสเพิ่ม
7. พัก (Recover) ที่ 37°C, เขย่า 200 rpm นาน 60 นาที
8. เพาะเชื้อ (Plate) 100 µL ลงบน LB agar ampicillin บ่มข้ามคืนที่ 37°C
9. นับ (Count) โคโลนีและคำนวณ: ประสิทธิภาพ (cfu/µg) = จำนวนโคโลนี × dilution factor × 1000 ÷ ปริมาณ DNA (pg)

เคล็ดลับและข้อควรระวังเพื่อประสิทธิภาพสูงสุด

การแก้ไขปัญหาทั่วไป