วิธีเตรียม DMEM Media: ขั้นตอนและเคล็ดลับสำหรับห้องปฏิบัติการมหาวิทยาลัยไทย

ปัญหาค่า pH ที่ไม่คงที่ ค่าความเข้มข้นสารละลาย (osmolality) ที่พุ่งสูง หรือการเกิดตะกอนขุ่นมัว อาจทำให้เซลล์ยึดเกาะตัวได้ยากและเสียเวลาในการทำ passaging เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าโดยที่คุณไม่ทราบสาเหตุ การปนเปื้อนระหว่างการผสมหรือความร้อนที่ทำลายกรดอะมิโนมักส่งผลในภายหลังให้เซลล์มีอัตราการรอดชีวิตต่ำและสัณฐานวิทยาที่ไม่สม่ำเสมอ วิธีเตรียม DMEM Media สำหรับงานเพาะเลี้ยงเซลล์ฉบับนี้จะแนะนำคุณตั้งแต่การเลือกสูตร การผสมที่สะอาด การปรับ pH และ osmolality ที่แม่นยำ ไปจนถึงการกรองฆ่าเชื้อและการจัดเก็บ เพื่อให้คุณได้อาหารเลี้ยงเชื้อที่มีคุณภาพคงที่ในทุกๆ Batch

ทำไมความสม่ำเสมอในการเตรียม DMEM จึงสำคัญต่อสุขภาพของเซลล์

ข้อผิดพลาดเพียงเล็กน้อยในค่า pH, osmolality หรือความเข้มข้นของไบคาร์บอเนตสามารถกระตุ้นการตอบสนองต่อความเครียดในเซลล์ไลน์ที่ไวต่อสิ่งเร้าได้ แม้แต่การขยับค่า pH เพียง 0.1 หน่วยจากช่วงเป้าหมาย 7.2 ถึง 7.4 ก็สามารถเปลี่ยนแปลงจลนพลศาสตร์การเจริญเติบโต (growth kinetics) และการแสดงออกของตัวรับ (receptor expression) ได้ การสร้างมาตรฐานในกระบวนการเตรียมจะช่วยลดความผันแปรระหว่าง Batch และลดวงจรการแก้ไขปัญหาที่ตามมาโดยตรง

การเตรียม DMEM เองในห้องปฏิบัติการเป็นทางเลือกที่คุ้มค่าเมื่อคุณต้องการระดับกลูโคสแบบเฉพาะเจาะจง การใช้ HEPES บัฟเฟอร์ หรือสารอาหารเสริมที่กำหนดเอง นอกจากนี้ยังช่วยให้ห้องปฏิบัติการในมหาวิทยาลัยและโรงพยาบาลของไทยควบคุมต้นทุนได้โดยตรงและเป็นอิสระจากระยะเวลาการนำเข้าที่ยาวนาน สำหรับข้อมูลพื้นฐานเกี่ยวกับการเลือก base media และตรรกะในการเลือกสารอาหารเสริม โปรดดู ประเภทของอาหารเลี้ยงเซลล์และวิธีการเลือกสำหรับห้องปฏิบัติการวิจัยไทย

สภาพแวดล้อมของห้องปฏิบัติการไทยเพิ่มความซับซ้อนในเชิงปฏิบัติ ความชื้น เครื่องปรับอากาศที่ไม่ทำงานตลอดเวลา และการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิตามฤดูกาลอาจส่งผลต่อคุณภาพของน้ำบริสุทธิ์และความเสถียรของเครื่องวัด pH ควรวางแผนตารางการผสม การสอบเทียบ (calibration) และการจัดเก็บให้สอดคล้องกับสภาวะเหล่านี้

ข้อควรตัดสินใจก่อนเริ่มคือ: การเตรียมใหม่เทียบกับการใช้อาหารเลี้ยงเชื้อแบบสำเร็จรูป (ready-to-use) อาหาร DMEM แบบเหลวที่ผ่านการกรองฆ่าเชื้อมาแล้วช่วยประหยัดเวลาและลดความเสี่ยงจากการปนเปื้อน ส่วนการเตรียมเองจะได้เปรียบเมื่อต้องการสูตรเฉพาะหรือมีงบประมาณจำกัด

อุปกรณ์ สารเคมีภัณฑ์และอุปกรณ์ป้องกันความปลอดภัยที่ต้องเตรียม

รายการอุปกรณ์

ตู้ชีวนิรภัย (Class II biosafety cabinet) — การปฏิบัติงานที่เปิดขวดทั้งหมดต้องทำภายในตู้นี้
เครื่องกวนสารแม่เหล็ก (magnetic stirrer) และแท่งกวนปราศจากเชื้อ — สำหรับละลายผงอาหารโดยไม่ให้จับตัวเป็นก้อน
เครื่องวัด pH ที่ผ่านการสอบเทียบ — ให้ทำการสอบเทียบ 3 จุด (3-point calibration) ในวันที่ใช้งาน
เครื่องวัดออสโมลาลิตี้ (osmometer) — แนะนำเป็นอย่างยิ่ง เพื่อตรวจสอบค่าความเข้มข้นก่อนการกรอง
ชุดกรองฆ่าเชื้อขนาด 0.22 µm แบบติดตั้งบนขวด (bottle-top filter) — ชนิดเมมเบรน PES หรือ PVDF
ขวดปราศจากเชื้อชนิด PETG หรือ PP — สำหรับรองรับสารละลายที่ผ่านการกรองและจัดเก็บในขั้นตอนสุดท้าย
ปิเปตแบบเซโรโลยี (serological pipettes), ไมโครปิเปต และถาดรองสารปราศจากเชื้อ — สำหรับการเติมสารอาหารเสริม
ป้ายระบุชื่อและนาฬิกาจับเวลา — สำหรับการตรวจสอบย้อนกลับและกำหนดขั้นตอนเวลา

รายการเคมีภัณฑ์

ผง DMEM หรือสูตรเข้มข้น 10x — กลุ่มผลิตภัณฑ์ Cell Culture Media & Buffers ของ Merck ครอบคลุมทั้งสูตรกลูโคสสูง กลูโคสต่ำ ทั้งที่มีและไม่มีโซเดียมไพรูเวต และสูตรที่ปราศจากฟีนอลเรด
น้ำปราศจากเชื้อสำหรับเพาะเลี้ยงเซลล์ — ไม่ใช่น้ำประปา หรือน้ำ Milli-Q ทั่วไปเว้นแต่จะผ่านการตรวจสอบว่าใช้สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ได้
โซเดียมไบคาร์บอเนต — ปริมาณขึ้นอยู่กับการตั้งค่า CO2 (ดูหัวข้อการผสมสูตร)
HEPES บัฟเฟอร์ — เลือกใช้ได้ 10 ถึง 25 mM ในกรณีที่ควบคุมระดับ CO2 ได้จำกัด
L-glutamine หรือ L-alanyl-L-glutamine dipeptide — ความเข้มข้นสุดท้าย 2 mM
โซเดียมไพรูเวต — 110 mg/L หากเซลล์ไลน์หรือโปรโตคอลของคุณต้องการ
FBS ที่ผ่านการฆ่าเชื้อด้วยความร้อน (heat-inactivated) — 10% v/v เว้นแต่จะระบุเป็นอย่างอื่น
Penicillin-streptomycin — 1x (100 U/ml และ 100 µg/ml) หาก SOP ของคุณมีระบุการใช้ยาปฏิชีวนะ
สารละลาย 1 N HCl และ 1 N NaOH ปราศจากเชื้อ — สำหรับการปรับค่า pH เท่านั้น ต้องเตรียมและทำให้ปราศจากเชื้อก่อนใช้งาน

วัสดุสิ้นเปลืองและอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (PPE)

ชุดกรอง 0.22 µm PES
เอทานอล 70% สำหรับฆ่าเชื้อพื้นผิวภายในตู้ชีวนิรภัย
หลอดปราศจากเชื้อสำหรับการแบ่งสารอาหารเสริม
เสื้อกาวน์ ถุงมือไนไตรล์ และอุปกรณ์ป้องกันดวงตา

ข้อควรระวังสำคัญ: ห้ามนำผง DMEM, อาหารเลี้ยงเชื้อที่ผสมเสร็จแล้ว หรือ FBS เข้าเครื่องนึ่งฆ่าเชื้อ (autoclave) การนึ่งจะทำลายกรดอะมิโน วิตามิน และปัจจัยการเจริญเติบโต (growth factors) ที่ไวต่อความร้อน ให้ใช้วิธีการกรองผ่านขนาด 0.22 µm เท่านั้น และใช้น้ำที่ผ่านการรับรองสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ตลอดกระบวนการ

กลุ่มผลิตภัณฑ์ Cell Culture Media & Buffers ของ Merck รวมถึงสูตร DMEM แบบเหลวที่ผ่านการกรองฆ่าเชื้อแล้ว (เช่น D6429 สูตรกลูโคสสูงพร้อมโซเดียมไบคาร์บอเนต, L-glutamine และโซเดียมไพรูเวต หรือ D5796 สูตรที่ไม่มีโซเดียมไพรูเวต) ซึ่งช่วยให้คุณข้ามขั้นตอนการละลายและการกรองไปได้เลยเมื่อความรวดเร็วเป็นสิ่งสำคัญที่สุด

วิธีเตรียม DMEM Media: การเลือกสูตรที่เหมาะสม

ระดับกลูโคส

สูตรกลูโคสสูง (4.5 g/L) รองรับเซลล์ไลน์ที่เพิ่มจำนวนรวดเร็ว เช่น HeLa, HEK293 และเซลล์มะเร็งหลายชนิด นอกจากนี้ยังเป็นบัฟเฟอร์ป้องกันความเครียดจากการขาดออกซิเจนในตู้บ่มที่มีระดับออกซิเจนต่ำ สูตรกลูโคสต่ำ (1.0 g/L) มีค่าใกล้เคียงกับระดับทางสรีรวิทยา ใช้สำหรับการศึกษาที่ไวต่อระดับน้ำตาล การแยกตัวของเซลล์ไขมัน (adipocyte differentiation) และการทดลองด้านเมตาบอลิซึม สูตรที่ไม่มีกลูโคสจะใช้คู่กับกาแลคโตสหรือสารให้พลังงานอื่นๆ ในงานวิจัยเฉพาะทาง

โซเดียมไพรูเวต ฟีนอลเรด และ HEPES

โซเดียมไพรูเวตที่ 110 mg/L ช่วยส่งเสริมเมตาบอลิซึมพลังงานและช่วยให้เซลล์ฟื้นตัวจากความเครียดออกซิเดชัน ควรใส่ลงไปเว้นแต่การทดลองของคุณจะระบุให้งดเว้น ฟีนอลเรดเป็นตัวบ่งชี้ค่า pH (pH indicator) แบบมองเห็นได้: สีแดงอมส้มที่ pH 7.4, สีเหลืองที่ pH ต่ำกว่า 7.0, และสีชมพูอมม่วงที่สูงกว่า 7.6 ควรละเว้นหากทำการตรวจวัดด้วยการเรืองแสง (fluorescence assay) เนื่องจากสีจะรบกวนสัญญาณ เติม HEPES 10 ถึง 25 mM เมื่อตู้บ่มของคุณควบคุมระดับ CO2 ได้ไม่เสถียร หรือเมื่อต้องนำอาหารเลี้ยงเชื้อออกมานอกตู้บ่มเป็นเวลานาน

ความสมดุลของโซเดียมไบคาร์บอเนตและ CO2

ระดับไบคาร์บอเนตที่ถูกต้องขึ้นอยู่กับเปอร์เซ็นต์ CO2 ในตู้บ่มของคุณ ที่ CO2 5% โดยไม่มี HEPES ให้ตั้งเป้าที่ NaHCO3 ประมาณ 3.7 กรัมต่อลิตร แต่ถ้าเติม 25 mM HEPES ให้ลดเหลือประมาณ 2.2 กรัมต่อลิตร ที่ระดับ CO2 10% ให้ลดไบคาร์บอเนตลงอีกเหลือประมาณ 2.2 กรัมต่อลิตรโดยไม่มี HEPES โปรดตรวจสอบ SKU บนฉลากผง DMEM ของคุณ: บางสูตรอาจมีการผสมโซเดียมไบคาร์บอเนตมาให้แล้ว และการใส่ซ้ำจะทำให้ค่า osmolality สูงเกินช่วงที่กำหนด

คู่มือการตัดสินใจเลือกสูตรอย่างรวดเร็ว

กลูโคสสูง, มีโซเดียมไพรูเวต, มีฟีนอลเรด

เซลล์ไลน์ที่เติบโตเร็ว (HeLa, HEK293, CHO)
การบำรุงรักษาและการขยายจำนวนเซลล์ทั่วไป
การทำ passaging ตามปกติภายใต้ CO2 ที่เสถียร

กลูโคสต่ำ, ไม่มีโซเดียมไพรูเวต, ไม่มีฟีนอลเรด

การศึกษาสภาวะเมตาบอลิซึมและเซลล์ที่ไวต่อกลูโคส
การตรวจวัดแบบเรืองแสงหรือลูมิเนสเซนต์
โปรโตคอลการแยกตัวของเซลล์ไขมัน

กลูโคสสูง, มี HEPES, มีฟีนอลเรด

ตู้บ่ม CO2 ที่ไม่เสถียร หรือการทำงานบนโต๊ะปฏิบัติการ
การขนส่งเซลล์ระหว่างสถานที่
การส่องกล้องต่อเนื่องภายนอกตู้บ่ม

ข้อมูลจำเพาะก่อนกรอง: pH 7.2 ถึง 7.4 วัดที่อุณหภูมิห้อง, osmolality 280 ถึง 320 mOsm/kg หลังจากเกลือทั้งหมดละลายแล้ว โปรดทราบว่าอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี HEPES หากสัมผัสกับแสงฟลูออเรสเซนต์เข้มข้นอาจเกิดไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ซึ่งก่อให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ (phototoxicity) ระหว่างการถ่ายภาพ ควรเก็บอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี HEPES ให้พ้นจากแสงโดยตรง

ขั้นตอนการละลายผง DMEM และการตั้งค่า pH และ Osmolality

เตรียมพื้นที่ทำงาน: เช็ดตู้ชีวนิรภัยด้วยเอทานอล 70% ทิ้งไว้ 15 นาทีสำหรับการฆ่าเชื้อด้วย UV หาก SOP ของตู้กำหนด นำขวดปราศจากเชื้อ แท่งกวน และเคมีภัณฑ์ทั้งหมดเข้าไปในตู้
เติมน้ำปราศจากเชื้อสำหรับเพาะเลี้ยงเซลล์ 900 ml: ลงในขวดปราศจากเชื้อขนาด 1 ลิตร เริ่มกวนด้วยเครื่องกวนแม่เหล็กอย่างช้าๆ
ละลายผง DMEM: ค่อยๆ โรยผงลงในน้ำขณะที่กำลังกวน ห้ามเทลงไปทั้งหมดในคราวเดียว กวนจนสารละลายใสไม่มีตะกอนที่มองเห็นได้ โดยทั่วไปใช้เวลา 10 ถึง 20 นาทีขึ้นอยู่กับสูตร
สำหรับสูตรเข้มข้น 10x DMEM: เจือจาง 100 ml ในน้ำปราศจากเชื้อ 900 ml ขณะกวน ตรวจสอบว่าสูตรเข้มข้นมีโซเดียมไบคาร์บอเนตอยู่แล้วหรือไม่ก่อนดำเนินการต่อ
เติมโซเดียมไบคาร์บอเนต: ชั่งน้ำหนักปริมาณที่คำนวณได้ (ประมาณ 3.7 กรัมต่อลิตรสำหรับ CO2 5% โดยไม่มี HEPES, หรือประมาณ 2.2 กรัมต่อลิตรพร้อม HEPES 25 mM) และกวนจนละลายหมด
วัดค่า pH: ใช้เครื่องวัด pH ที่สอบเทียบแล้ว (การสอบเทียบ 3 จุดต้องทำเสร็จภายในวันเดียวกัน) อ่านค่าที่อุณหภูมิห้อง ปรับค่าโดยการหยด 1 N HCl ปราศจากเชื้อเพื่อลดค่า หรือ 1 N NaOH ปราศจากเชื้อเพื่อเพิ่มค่า โดยตั้งเป้าที่ pH 7.2 ถึง 7.4 คาดหวังว่า pH จะลดลงเล็กน้อยเมื่ออยู่ที่ 37°C ในสภาวะ CO2 5%
ปรับปริมาตรสุดท้าย: เติมน้ำปราศจากเชื้อให้ได้ปริมาตร 1.0 ลิตรพอดี กวนเบาๆ เพื่อป้องกันการเกิดฟอง
ตรวจสอบ osmolality: เป้าหมายอยู่ที่ 280 ถึง 320 mOsm/kg หากต้องการเพิ่ม osmolality ให้เติม 5 M NaCl ปราศจากเชื้อทีละน้อยแล้วกวนตรวจสอบใหม่ หากต้องการลด ให้เติมน้ำปราศจากเชื้อทีละน้อยแล้วตรวจสอบใหม่

ข้อควรระวังสำคัญ: ใช้เฉพาะ 1 N HCl หรือ 1 N NaOH ที่เตรียมสำเร็จและฆ่าเชื้อแล้วสำหรับการปรับ pH เท่านั้น ห้ามเติม NaOH แบบเม็ด, สารละลายสต็อกที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื้อ หรือกรดเข้มข้นลงในอาหารเลี้ยงเชื้อโดยตรง สิ่งเหล่านี้จะนำพาการปนเปื้อนมาและก่อให้เกิดการตกตะกอนเฉพาะจุดที่ไม่สามารถแก้ไขได้

พารามิเตอร์	เป้าหมาย	หมายเหตุ
pH (อุณหภูมิห้อง)	7.2 ถึง 7.4	วัดก่อนการกรอง; ค่าจะเปลี่ยนเล็กน้อยที่ 37°C ในสภาวะ CO2
Osmolality	280 ถึง 320 mOsm/kg	ตรวจสอบหลังจากเกลือละลายหมดและปรับปริมาตรเป็น 1.0 ลิตร
NaHCO3 (CO2 5%, ไม่มี HEPES)	~3.7 g/L	ลดเหลือ ~2.2 g/L เมื่อใช้ HEPES 25 mM
NaHCO3 (CO2 10%, ไม่มี HEPES)	~2.2 g/L	ตรวจสอบว่า SKU ของผงไม่ได้รวม NaHCO3 ไว้แล้ว
ความใสของสารละลาย	ใส ไม่มีตะกอน	ตะกอนแสดงถึงการละลายที่ไม่สมบูรณ์หรือการตกตะกอน

การกรองฆ่าเชื้อ การเติมสารอาหารเสริม และการบรรจุ

เตรียมการกรองภายในตู้ชีวนิรภัย: ติดตั้งชุดกรองฆ่าเชื้อขนาด 0.22 µm PES เข้ากับขวดรับสารที่ปราศจากเชื้อ ห้ามใช้แรงดันเกินค่าที่กำหนดของชุดกรอง เชื่อมต่อกับปั๊มสุญญากาศที่มีกับดักปราศจากเชื้อ (sterile trap) คั่นกลาง
กรองสารละลาย DMEM ที่ปรับค่าแล้ว: ค่อยๆ เทอาหารเลี้ยงเชื้อลงในกรอง หลีกเลี่ยงการกระเด็น รอให้การกรองสมบูรณ์ก่อนเปิดขวดรับสาร ทิ้งชุดกรองหลังใช้งาน
เติมสารอาหารเสริมที่ไวต่อความร้อนภายหลังการกรอง ตามลำดับดังนี้:
- FBS: 10% v/v (100 ml ต่อลิตร) เว้นแต่โปรโตคอลระบุเป็นอย่างอื่น; ใช้ FBS ที่ผ่านการฆ่าเชื้อด้วยความร้อนแล้ว
- L-glutamine หรือ L-alanyl-L-glutamine dipeptide: ความเข้มข้นสุดท้าย 2 mM
- Penicillin-streptomycin: 1x (100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin) หากต้องการ
- โซเดียมไพรูเวต: 1 mM หากเลือกใช้ในสูตรของคุณ
ผสมเบาๆ: คว่ำขวด 5 ถึง 10 ครั้ง ห้ามใช้เครื่อง Vortex เพราะจะทำให้โปรตีนใน FBS สูญเสียสภาพและทำให้เกิดฟองซึ่งจะรบกวนการปิเปต
แบ่งบรรจุลงในขวดปราศจากเชื้อที่ระบุชื่อหรือหลอด 50 ml: แต่ละฉลากต้องระบุ: ชื่ออาหารเลี้ยงเชื้อ, ระดับความเข้มข้นกลูโคส, สารอาหารเสริมทั้งหมดและความเข้มข้นสุดท้าย, วันที่เตรียม, ชื่อผู้เตรียม และวันหมดอายุ
จัดเก็บที่ 2 ถึง 8°C โดยป้องกันแสง อาหาร DMEM ที่ผสม FBS มักมีประสิทธิภาพดีนาน 4 ถึง 6 สัปดาห์ในสภาวะนี้ อุ่นแบ่งแต่ละส่วนให้ได้ 37°C ก่อนใช้งานทันที อย่าอุ่นขวดสต็อกหลักซ้ำๆ

สำหรับการติดตามผลหลังเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อ เวิร์กโฟลว์ด้าน cell culture analysis ของคุณจะเป็นตัวกำหนดว่าคุณสามารถยืนยันได้เร็วแค่ไหนว่า Batch ใหม่รองรับการเจริญเติบโตและสัณฐานวิทยาตามที่คาดหวัง

เคล็ดลับ ข้อควรระวัง และการตรวจสอบคุณภาพ

คำเตือน: ห้ามนำอาหารเลี้ยงเชื้อที่ผสมเสร็จแล้วหรือ FBS เข้าเครื่องนึ่งฆ่าเชื้อ (autoclave) เด็ดขาด การฆ่าเชื้อ FBS ด้วยความร้อน (56°C นาน 30 นาที) เป็นเพียงการทำลายโปรตีนเสริม (complement-inactivation) ไม่ใช่วิธีการฆ่าเชื้อ การนึ่งจะทำลายกรดอะมิโน วิตามิน และกลูโคส ทำให้อาหารเลี้ยงเชื้อไม่เหมาะสำหรับการเพาะเลี้ยง

เคล็ดลับสำหรับการเตรียม DMEM ที่เชื่อถือได้

สอบเทียบเครื่องวัด pH ในวันที่เตรียมโดยใช้การสอบเทียบ 3 จุดกับบัฟเฟอร์ใหม่
วัด pH ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นตรวจสอบพฤติกรรมของอาหารที่ 37°C ใน CO2 5% ด้วยขวดทดสอบนาน 24 ชั่วโมง
บันทึกค่า osmolality และ pH บนฉลากขวดเพื่อให้ตรวจสอบย้อนกลับได้ครบถ้วน
แบ่งสารอาหารเสริม (FBS, L-glutamine, penicillin-streptomycin) เป็นปริมาณการใช้ครั้งเดียวเพื่อหลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ
ตรวจสอบการปนเปื้อน (sterility control) นาน 48 ถึง 72 ชั่วโมง: บ่มตัวอย่างที่ปิดสนิทที่ 37°C โดยไม่มีเซลล์และตรวจสอบความขุ่น
ใช้คู่ DMEM และ FBS Lot เดียวกันสำหรับการทดลองระยะยาวเพื่อลดความผันแปรระหว่าง Lot
ป้องกันอาหารที่ใช้ HEPES บัฟเฟอร์จากแสงฟลูออเรสเซนต์หรือ UV เพื่อป้องกันการเกิดเปอร์ออกไซด์ที่เป็นพิษ
ลดการเกิดฟองระหว่างผสม; ฟองที่ผิวหน้าอาจรวมตัวของเอนโดท็อกซิน (endotoxin) และรบกวนความแม่นยำในการปิเปต

การตรวจสอบคุณภาพก่อนใช้

การตรวจสอบด้วยสายตา: อาหารควรใส โดยฟีนอลเรดแสดงสีแดงอมส้มที่ pH 7.4 หากพบความขุ่น ตะกอน หรือสีที่อยู่นอกเหนือช่วงที่คาดหวัง ให้ทิ้งทันที ควรทำการทดสอบความปลอดเชื้อ (48 ถึง 72 ชั่วโมงที่ 37°C) ในทุก Batch ใหม่

สำหรับการศึกษาที่ยาวนานขึ้น ให้ตรวจสอบอัตราการเจริญเติบโตสั้นๆ เมื่อเปลี่ยน Lot อาหารเลี้ยงเชื้อ เพาะเซลล์ลงในหลุมทดสอบที่ความหนาแน่นมาตรฐานและเปรียบเทียบระยะเวลาการแบ่งเซลล์ (doubling time) กับค่าเฉลี่ยย้อนหลัง เครื่องมืออย่าง Scepter 3.0 handheld cell counter ให้การนับจำนวนเซลล์ที่รวดเร็วและแม่นยำเพื่อยืนยันว่าการเติบโตยังเป็นไปตามแผนโดยไม่รบกวนเซลล์หลักของคุณ

การติดตามความหนาแน่นของเซลล์ (confluence) หลังจากเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อให้ข้อมูลได้ดีเช่นกัน เครื่อง Millicell DCI Digital Cell Imager ช่วยให้คุณติดตามการยึดเกาะและสัณฐานวิทยาในตู้บ่มได้โดยไม่ต้องรบกวนเซลล์ ช่วยให้พบปัญหาตั้งแต่เนิ่นๆ แทนที่จะตรวจพบในขั้นตอนการ passaging ครั้งต่อไป

หมายเหตุเกี่ยวกับความเสถียรของเคมีภัณฑ์

L-glutamine ในสารละลายจะสลายตัวเป็น pyroglutamate และแอมโมเนียภายในไม่กี่วันเมื่ออยู่ที่ 37°C และภายในไม่กี่สัปดาห์ที่ 4°C ทางเลือกประเภท L-alanyl-L-glutamine dipeptide มีความเสถียรมากกว่ามากและลดความเสี่ยงของการขาดกลูโคสระหว่างการทดลอง จัดเก็บอาหารเลี้ยงเชื้อผสมเสร็จที่ 2 ถึง 8°C ในที่มืดและทิ้งขวดใดก็ตามที่มีการเปลี่ยนแปลงของสี ความใส หรือ pH

การแก้ไขปัญหาการเตรียม DMEM

ปัญหา	สาเหตุที่เป็นไปได้	วิธีแก้ไข
ความขุ่นหรือตะกอนสีขาวหลังผสม	ผงละลายไม่หมด, การเกิดตะกอนแคลเซียมฟอสเฟตจากการเติมผิดลำดับ หรือน้ำปนเปื้อน	ละลายผงอย่างช้าๆ ในน้ำ 90% ของปริมาตรสุดท้ายขณะกวน ตรวจสอบเกรดของน้ำ หากเกิดตะกอนหลังเติม FBS ให้เช็คระดับแคลเซียมและฟอสเฟตใน DMEM สูตรนั้น อย่ากรองหรือใช้ Batch ที่ขุ่น
pH สูงกว่า 7.6 หลัง 24 ชั่วโมงในตู้บ่ม	ใช้ NaHCO3 มากเกินไปสำหรับ % CO2, หรือ CO2 ขัดข้อง	ตรวจสอบการตั้งค่า CO2 และการสอบเทียบตู้บ่ม ลด NaHCO3 ให้ตรงกับระดับ CO2 ที่ถูกต้อง เติม HEPES 20 ถึง 25 mM เพื่อบัฟเฟอร์ต่อความผันผวนของ CO2
pH ต่ำกว่า 7.0 หลัง 24 ชั่วโมงในตู้บ่ม	NaHCO3 ไม่เพียงพอ, CO2 มากเกินไป, หรือความหนาแน่นเซลล์สูงทำให้ไบคาร์บอเนตหมดเร็ว	เพิ่ม NaHCO3 ให้ถูกต้องตามระดับ CO2 ตรวจสอบการสอบเทียบ CO2 ลดความหนาแน่นการเพาะเซลล์หรือเพิ่มปริมาตรอาหารเลี้ยงเชื้อต่อขวด
Osmolality อยู่นอกช่วง	ใส่ NaHCO3 เกิน (ผงมีมาแล้ว), ปริมาตรน้ำผิด, หรือชั่งน้ำหนักไม่แม่นยำ	ตรวจสอบฉลากสูตรผงสำหรับ NaHCO3 ที่มีอยู่เดิม คำนวณปริมาตรใหม่ หากต้องการลด osmolality ให้เติมน้ำปราศจากเชื้อทีละน้อยแล้วเช็คใหม่ หากต้องการเพิ่ม ให้เติม 5 M NaCl ทีละน้อย
กรองผ่านเมมเบรน 0.22 µm ได้ช้า	ผงละลายไม่หมด, มีอนุภาคปนเปื้อนมาก, หรือเมมเบรนกรองตัน	ตรวจสอบการละลายให้สมบูรณ์ก่อนกรอง กรองผ่านขนาด 0.45 µm ก่อนหากมีตะกอนมาก เปลี่ยนชุดกรองใหม่; ห้ามใช้เกินความจุต่อชุด
ฟีนอลเรดมีสีเหลืองก่อนเติมเซลล์	pH ต่ำกว่า 7.0 เนื่องจากไบคาร์บอเนตน้อย, โดน CO2 ก่อนปิดฝา, หรือน้ำเป็นกรด	วัด pH ใหม่และปรับด้วย 1 N NaOH ปราศจากเชื้อ ปิดฝาขวดเร็วๆ หลังแบ่งบรรจุ ตรวจสอบเกรดน้ำ อาหารสีเหลืองตั้งแต่เริ่มหมายถึง pH เป็นกรดก่อนนำเซลล์เข้า
เซลล์ตายหรือเกาะตัวไม่ดีหลังเปลี่ยน Lot อาหาร	ความเข้มข้นกลูโคสต่างกัน, FBS ไม่เข้ากัน, osmolality เปลี่ยน, หรือ L-glutamine สลาย	เปรียบเทียบสเปก Batch ใหม่กับ Lot ก่อนหน้า ทดสอบการเจริญเติบโตเปรียบเทียบ ตรวจสอบว่าไม่ได้เปลี่ยน Lot FBS พร้อมกัน เช็คความสมบูรณ์ของ L-glutamine หากอาหารนานเกิน 4 สัปดาห์

การปฏิบัติตามวิธีเตรียม DMEM Media สำหรับงานเพาะเลี้ยงเซลล์นี้ ตั้งแต่การเลือกสูตรไปจนถึงการกรองฆ่าเชื้อและการจัดเก็บ ช่วยให้คุณมีจุดเริ่มต้นที่ทำซ้ำได้ทุกครั้ง การเตรียมที่สม่ำเสมอช่วยลดวงจรการแก้ไขปัญหา ทำให้การเติบโตคงที่ในทุกรอบ passaging และปกป้องการทดลองจากตัวแปรที่หลีกเลี่ยงได้ในขั้นตอนการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ

คำถามที่พบบ่อย

ควรเติม FBS ก่อนหรือหลังการกรองฆ่าเชื้อ?

ให้เติม FBS ที่ผ่านการฆ่าเชื้อด้วยความร้อนแล้วหลังจากการกรอง base DMEM โปรตีนใน FBS อาจอุดตันเมมเบรน 0.22 µm และสูญเสียสภาพจากแรงเฉือนระหว่างการกรอง ผสมเบาๆ ในตู้ชีวนิรภัยหลังจากเติม และห้ามนำอาหารเลี้ยงเชื้อที่ผสมเสร็จแล้วไปกรองซ้ำเว้นแต่ SOP จะระบุโดยเฉพาะ

จะตั้งค่าไบคาร์บอเนตและ HEPES อย่างไรถ้าไม่มีตู้บ่ม CO2?

ใช้ HEPES 20 ถึง 25 mM และลด NaHCO3 ลงเหลือประมาณ 2.2 กรัมต่อลิตร ตรวจสอบความเสถียรของ pH นาน 24 ชั่วโมงที่ 37°C ในตู้บ่มมาตรฐาน และป้องกันอาหารจากแสงเข้มข้นเพื่อเลี่ยงความเป็นพิษจาก HEPES หากเซลล์มีอาการเครียด ให้ปรับความเข้มข้น HEPES หรือเปลี่ยนไปใช้สูตรอาหารที่ไม่พึ่งพา CO2

ถ้าไม่มีเครื่อง osmometer เพื่อตรวจสอบ osmolality จะทำอย่างไร?

ให้ยึดตามปริมาตรสูตรมาตรฐานและแหล่งน้ำที่ผ่านการตรวจสอบ จากนั้นติดตามสัณฐานวิทยาของเซลล์และระยะเวลาการแบ่งตัว (doubling time) เพื่อใช้เป็นตัวบ่งชี้การทำงานของ osmolality ให้อยู่ในช่วงที่เหมาะสม หากมีเครื่องวัดที่แล็บอื่น ให้ตรวจสอบอย่างน้อยหนึ่ง Batch แล้วทำตามสูตรเดิมนั้นอย่างเคร่งครัด อาการเซลล์บวมหรือแฟบโดยไม่ทราบสาเหตุเป็นสัญญาณที่ต้องตรวจสอบ osmolality ทันที

อาหารเลี้ยงเชื้อผสมเสร็จเก็บได้นานเท่าไร?

เก็บอาหาร DMEM ผสม FBS ที่ 2 ถึง 8°C ในที่มืด; ส่วนใหญ่จะใช้งานได้ดีนาน 4 ถึง 6 สัปดาห์ ให้ทิ้งทันทีหากสี ความใส หรือ pH เปลี่ยนไป และหลีกเลี่ยงการอุ่นและแช่เย็นขวดสต็อกซ้ำเกินหนึ่งครั้ง อุ่นเฉพาะปริมาณที่ต้องการทันทีก่อนใช้งาน

สามารถเปลี่ยน L-glutamine ด้วยแหล่ง dipeptide ที่เสถียรได้ไหม?

ได้ L-alanyl-L-glutamine มีความเสถียรในสารละลายมากกว่ามาก สลายตัวช้ากว่า free L-glutamine อย่างเห็นได้ชัด และเหมาะสำหรับเซลล์ไลน์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมส่วนใหญ่ เติมให้ถึงระดับเทียบเท่า 2 mM glutamine เว้นแต่โปรโตคอลเซลล์ไลน์ของคุณจะระบุเป็นอย่างอื่น ยืนยันความเข้ากันได้กับเซลล์ไลน์ของคุณก่อนเปลี่ยนระหว่างการทดลอง

ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ

ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค

Merck

Cell Culture Media & Buffers

ดูเพิ่มเติม →

ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express

เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ Cell Culture Media Fundamentals จาก Merck และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE

ส่งคำถาม เพิ่มเพื่อน LINE