วิธีเตรียมตัวอย่างก่อน HPLC ลดปัญหาคอลัมน์อุดตันและ Baseline Noise

เมื่อค่าความดัน (backpressure) เพิ่มสูงขึ้นหลังจากฉีดตัวอย่างไปเพียงยี่สิบครั้ง, Baseline ที่พุ่งสูงขึ้นกลางการรันแบบ Gradient หรือการปรากฏของพีกแปลกปลอม (ghost peaks) ในสารละลาย Blank ปัญหาเหล่านี้มักมีจุดเริ่มต้นก่อนที่ตัวอย่างจะเดินทางไปถึงคอลัมน์ การฉีดตัวอย่างที่ไม่สะอาดจะทำให้เกิดการสะสมของอนุภาคบน Frit, การสะสมของฟอสโฟลิพิดบนเฟสอยู่กับที่ (stationary phase) และการนำ Matrix ที่รบกวนพีกของสารวิเคราะห์ปริมาณต่ำเข้ามาในระบบ คู่มือฉบับนี้จะแนะนำขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง HPLC (เตรียมตัวอย่าง HPLC) เพื่อลดปัญหาที่เกิดกับคอลัมน์ เพื่อให้มั่นใจได้ว่าตัวอย่างที่ฉีดมีความสะอาด ปกป้องคอลัมน์ของคุณ และรักษาระดับ Baseline ให้คงที่ตั้งแต่การฉีดครั้งแรกจนถึงครั้งสุดท้าย

เหตุผลที่การ เตรียมตัวอย่าง HPLC เพื่อลดปัญหาคอลัมน์มีความสำคัญ

อนุภาคที่ไม่ผ่านการกรองและโปรตีนที่ตกตะกอนคือสาเหตุหลักที่ทำให้อุดตันบริเวณ Frit เมื่อ Frit อุดตัน ค่าความดันจะเพิ่มขึ้น รูปพีกจะกว้างขึ้น และคอลัมน์ของคุณจะต้องถูกเปลี่ยนก่อนกำหนด ซึ่งสร้างความเสียหายอย่างรวดเร็วโดยเฉพาะในงานวิเคราะห์ปริมาณมาก

ส่วนประกอบของ Matrix ยังสร้างปัญหาที่ซับซ้อนยิ่งกว่า ฟอสโฟลิพิด, สารสี และสารลดแรงตึงผิวอาจแยกตัวออกมาพร้อมกับสารวิเคราะห์ หรือรั่วไหลออกมาใน Baseline ตลอดการรันแบบ Gradient ส่งผลให้เกิด Noise สูง, การรบกวนการแตกตัวเป็นไอออนในการตรวจวัดด้วย MS และพีกแปลกปลอมที่ทำให้การวิเคราะห์ข้อมูลทำได้ยาก

โปรดให้ความสำคัญกับการทำความสะอาดตัวอย่างเสมอเมื่อต้องทำงานกับ Matrix ทางชีวภาพหรืออาหารที่มีความซับซ้อน, การวิเคราะห์สารที่ความเข้มข้นต่ำ, การใช้คอลัมน์ขนาดแคบหรือขนาดอนุภาคต่ำกว่า 2 µm หรือเมื่อต้องทำงานภายใต้ความดัน UHPLC การเสียเวลาเตรียมตัวอย่างเพียงไม่กี่นาที จะช่วยป้องกันปัญหาที่ต้องเสียเวลาแก้เป็นชั่วโมง และหลีกเลี่ยงค่าใช้จ่ายในการเปลี่ยนคอลัมน์ที่เสื่อมสภาพก่อนเวลาอันควร

หากต้องการทำความเข้าใจว่าอุปกรณ์ของระบบโครมาโทกราฟีและความดันระบบสัมพันธ์กับคุณภาพตัวอย่างอย่างไร โปรดดูภาพรวมของเราเรื่อง High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

สิ่งที่คุณต้องใช้: อุปกรณ์, วัสดุสิ้นเปลือง และตัวทำละลาย

อุปกรณ์

เครื่องปั่นเหวี่ยงขนาดเล็กแบบแช่เย็น (refrigerated microcentrifuge) ที่สามารถทำความเร็วได้ถึง 14,000 g เป็นอุปกรณ์ที่สำคัญที่สุดในกระบวนการนี้ นอกจากนี้ควรมีเครื่องผสมสารแบบ Vortex, ปิเปตปรับปริมาตรได้ และหลอด Microtube ชนิด Low-bind ที่สะอาด การใช้กระแสไนโตรเจนหรือเครื่องระเหยตัวทำละลายจะช่วยในการเตรียมตัวอย่างหลังผ่าน SPE ส่วนเครื่องล้างด้วยคลื่นอัลตราโซนิก (sonicator) จะช่วยในการละลายตัวอย่างใหม่

สำหรับการใช้งานกับ Autosampler ให้เลือกใช้ Vial ชนิด Low-bleed ที่ผ่านการรับรองและมี Septa ที่เข้ากันได้เสมอ การปนเปื้อนของพลาสติไซเซอร์จากฝาปิด Vial ทั่วไปเป็นสาเหตุของการรบกวน Baseline ที่มักถูกมองข้าม

วัสดุสิ้นเปลืองและเครื่องมือ SPE

Millex® Syringe Filters (Merck/Sigma-Aldrich) ใช้สำหรับกำจัดอนุภาคตกค้างหลังจากการตกตะกอนหรือ SPE เลือกขนาดรูพรุน 0.20 µm สำหรับ UHPLC และคอลัมน์ขนาดอนุภาคต่ำกว่า 2 µm หรือ 0.45 µm สำหรับ HPLC ทั่วไป โดยมีเมมเบรนหลายชนิดให้เลือก เช่น PTFE, PVDF, nylon และ regenerated cellulose (RC) เพื่อให้เลือกใช้ได้เหมาะสมกับตัวทำละลายและความเสี่ยงในการจับกับสารวิเคราะห์

Supel™ Swift HLB SPE Cartridges ใช้ตัวดูดซับชนิด Polymeric แบบผสม (mixed-mode reversed-phase) ซึ่งสามารถกักเก็บสารวิเคราะห์ได้หลากหลายชนิดจาก Matrix ที่เป็นน้ำ ช่วยเร่งการพัฒนาวิธีวิเคราะห์สำหรับ Matrix ใหม่ๆ หรือซับซ้อนโดยลดจำนวนการทดสอบที่จำเป็นลง

Visiprep™ SPE Manifold ช่วยให้คุณสามารถรันตลับ SPE ได้สูงสุด 12 หรือ 24 ตลับพร้อมกันภายใต้สุญญากาศที่ควบคุมได้ การประมวลผลแบบขนานช่วยลดเวลาเตรียมตัวอย่างเมื่อเทียบกับการใช้กระบอกฉีดทีละตัว และช่วยให้การไหลของสารผ่านตลับสม่ำเสมอ

DPX HybridSPE® Tips ใช้สำหรับกำจัดฟอสโฟลิพิดอย่างรวดเร็วโดยตรงจากส่วนใส (supernatant) ที่ได้จากการตกตะกอนโปรตีน หัวทิปเหล่านี้ใช้กับปิเปตมาตรฐานและลดขั้นตอนการระเหยและการละลายซ้ำ ซึ่งช่วยลดเวลาการเตรียมตัวอย่างโดยรวมสำหรับวิธีวิเคราะห์พลาสมา

ตัวทำละลายและสารเคมี

ควรใช้ตัวทำละลายเกรด LC หรือ LC-MS เสมอ HPLC/UHPLC Solvents ของ TCI ได้แก่ acetonitrile (A0793, >99.5% GC), methanol (M0628, >99.8% GC) และ isopropyl alcohol (I0277, >99.5% GC) เกรดเหล่านี้ช่วยลด UV background และการรบกวน Baseline ซึ่งสำคัญมากสำหรับการวิเคราะห์สารปริมาณต่ำและการรันแบบ Gradient สำหรับตัวปรับปรุงเฟสเคลื่อนที่ (mobile phase modifiers) TCI ยังมี triethylamine (T4021, >99.5% GC) สำหรับการวิเคราะห์ที่ต้องการการจับคู่ไอออน (ion-pair) และการปรับปรุงรูปร่างพีก

สำหรับคำแนะนำโดยละเอียดเกี่ยวกับการเลือกเกรดตัวทำละลายและข้อกำหนดด้านความบริสุทธิ์สำหรับการตรวจวัดด้วย MS โปรดดูบทความของเราเรื่อง UHPLC-MS LiChrosolv® Solvents by Supelco®

กำจัดอนุภาคและโปรตีนก่อนฉีดตัวอย่าง

การตกตะกอนโปรตีนเป็นขั้นตอนมาตรฐานสำหรับพลาสมา, ซีรัม และ Matrix ชีวภาพที่มีโปรตีนสูง เพื่อกำจัดโปรตีนที่เป็นสาเหตุหลักของการอุดตัน Frit และคอลัมน์

โปรโตคอลการตกตะกอนโปรตีน

1. เตรียม acetonitrile แบบเย็น (เก็บที่อุณหภูมิ 4°C หรือแช่น้ำแข็ง) และเตรียมหลอด Low-bind ที่ติดฉลากไว้
2. เติม acetonitrile เย็น 3 ส่วนต่อตัวอย่าง 1 ส่วน (ตัวอย่างเช่น acetonitrile 300 µL ต่อพลาสมา 100 µL)
3. เขย่าด้วยเครื่อง Vortex นาน 30 วินาทีด้วยความเร็วปานกลางถึงสูงเพื่อให้สารผสมกันอย่างสมบูรณ์
4. แช่ในน้ำแข็งนาน 5 นาทีเพื่อส่งเสริมการรวมตัวของโปรตีน
5. ปั่นเหวี่ยงที่ 14,000 g เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4°C
6. ย้ายส่วนใส (supernatant) ที่ได้ลงในหลอด Low-bind ใหม่ด้วยความระมัดระวัง โดยหลีกเลี่ยงส่วนตะกอนโปรตีน

การกำจัดฟอสโฟลิพิดด้วย DPX HybridSPE® Tips

ฟอสโฟลิพิดที่เหลือจากการตกตะกอนโปรตีนเป็นสาเหตุหลักของการยับยั้งการแตกตัวเป็นไอออนและการเกิดขั้นบันไดบน Baseline ในการรันแบบ Gradient การเพิ่มขั้นตอนกำจัดฟอสโฟลิพิดทันทีหลังจากการตกตะกอนจะช่วยกำจัด Matrix เหล่านี้ก่อนที่จะเข้าไปถึงคอลัมน์

1. ใส่ DPX HybridSPE® Tip เข้ากับปิเปตที่เข้ากันได้
2. ดูดส่วนใสที่ผ่านการปั่นเหวี่ยงขึ้นมาและค่อยๆ ปล่อยผ่านตัวดูดซับในทิป
3. ปล่อยส่วนที่ผ่านการกรองลงใน Vial สะอาดเพื่อรอการกรองขั้นสุดท้าย

การกรองขั้นสุดท้ายด้วย Millex® Syringe Filters

แม้จะผ่านการปั่นเหวี่ยงและการตกตะกอนแล้ว แต่อาจยังมีอนุภาคขนาดเล็กตกค้าง การกรองเป็นปราการด่านสุดท้ายก่อนฉีดตัวอย่าง

1. เลือกขนาดรูพรุนของ Millex® Syringe Filter ให้ถูกต้อง: 0.20 µm สำหรับ UHPLC, 0.45 µm สำหรับ HPLC ทั่วไป
2. ทำให้เมมเบรนเปียกด้วยตัวทำละลายที่ใช้เจือจางประมาณ 100 ถึง 200 µL และทิ้งสารที่ผ่านตัวกรองส่วนแรก
3. กรองส่วนใสหรือสารละลายที่ผ่าน SPE ลงใน Vial สำหรับ Autosampler ที่สะอาด
4. ทิ้งสารที่ผ่านตัวกรองประมาณ 50 ถึง 100 µL แรก เพื่อล้างสิ่งปนเปื้อนที่อาจหลุดออกมาจากตัวกรอง
5. ปิด Vial ทันทีและเก็บที่อุณหภูมิ 4°C จนกว่าจะถึงเวลาฉีด

สำหรับ Matrix ที่มีอนุภาคมาก เช่น สารสกัดจากอาหารหรือสารละลายจากดิน ให้ปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วต่ำหรือทิ้งไว้ให้ตกตะกอนตามแรงโน้มถ่วงก่อน การกรองตัวอย่างที่มีความขุ่นสูงโดยตรงด้วยขนาด 0.45 µm จะทำให้อุดตันก่อนที่ตัวอย่างทั้งหมดจะผ่านไปได้ ซึ่งเป็นการเสียเวลาและวัสดุสิ้นเปลือง

การเลือกเมมเบรนมีผลต่อทั้งความเข้ากันได้ของตัวทำละลายและการดึงกลับของสารวิเคราะห์ ใช้ตารางด้านล่างเพื่อเลือกเมมเบรนให้เหมาะสมกับวิธีของคุณ:

ขั้นตอนการกรองนี้เป็นหัวใจสำคัญของการเตรียมตัวอย่าง HPLC เพื่อลดปัญหาคอลัมน์ ช่วยลดการอุดตันของ Frit และทำให้ Baseline มีเสถียรภาพซึ่งไม่มีวิธีแก้ปัญหาหลังคอลัมน์ใดทำได้

ทำความสะอาด Matrix ด้วย SPE เพื่อลดการอุดตันและสัญญาณรบกวน

การกรองช่วยกำจัดอนุภาค ส่วน SPE ช่วยกำจัดองค์ประกอบของ Matrix ที่ละลายอยู่ เช่น ฟอสโฟลิพิด, สารสี, เกลือ และสารภายในที่แยกตัวออกมาพร้อมกับสารวิเคราะห์และทำให้คุณภาพ Baseline ลดลง สำหรับ Matrix ที่ซับซ้อน SPE คือขั้นตอนที่ช่วยยืดอายุการใช้งานของคอลัมน์และเพิ่มอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน (signal-to-noise) ได้ดีที่สุด

โปรโตคอลการใช้ Supel™ Swift HLB SPE Cartridges บน Visiprep™ Manifold

1. ติดตั้ง Supel™ Swift HLB SPE Cartridges บน Visiprep™ SPE Manifold เชื่อมต่อระบบสุญญากาศและตั้งค่าในระดับต่ำ
2. เตรียมตลับ (Condition) ด้วยเมทานอล 1 mL และปล่อยให้ไหลผ่านด้วยสุญญากาศต่ำ อย่าปล่อยให้สารดูดซับแห้ง
3. ปรับสมดุล (Equilibrate) ด้วยน้ำเกรด LC หรือส่วนผสมของเฟสเคลื่อนที่เริ่มต้น ด้วยอัตราการไหลที่ควบคุม
4. โหลดตัวอย่างที่ผ่านการกรองใสไม่เกิน 1 mL ด้วยอัตราประมาณ 1 mL ต่อนาที สามารถใช้แรงโน้มถ่วงหรือสุญญากาศต่ำ หลีกเลี่ยงสุญญากาศสูงที่อาจทำให้สารดูดซับยุบตัว
5. ล้างด้วยน้ำเกรด LC 1 mL เพื่อกำจัดเกลือและสารรบกวนที่มีขั้ว
6. ล้างด้วยเมทานอล 5% ในน้ำ 1 mL เพื่อกำจัด Matrix ที่ยึดเกาะไม่แน่นโดยไม่ทำให้สารวิเคราะห์หลุดออกมา
7. ชะ (Elute) ด้วย acetonitrile หรือเมทานอล 1 mL ซึ่งอาจผสมกรดฟอร์มิกหรือแอมโมเนียมฟอร์เมต 0.1% เพื่อให้เข้ากับเฟสเคลื่อนที่ เก็บสารที่ชะได้ลงใน Vial ชนิด Low-bleed โดยตรง

Visiprep™ Manifold สามารถประมวลผลหลายตลับในการรันสุญญากาศครั้งเดียว ช่วยลดความไม่สม่ำเสมอจากการใช้กระบอกฉีดทีละตัวและทำให้เวิร์กโฟลว์ใช้งานได้จริงสำหรับตัวอย่าง 12 ตัวอย่างขึ้นไป

การกำจัดฟอสโฟลิพิดอย่างรวดเร็วด้วย DPX HybridSPE® Tips

สำหรับวิธีวิเคราะห์พลาสมาที่ต้องการกำจัดฟอสโฟลิพิดเป็นหลัก DPX HybridSPE® Tips ให้ทางเลือกที่เร็วกว่า SPE แบบเต็มขั้นตอน สามารถรวมเข้ากับขั้นตอนการตกตะกอนโปรตีนโดยไม่ต้องเพิ่มขั้นตอนการระเหย ทำให้รักษาปริมาณตัวอย่างที่รองรับได้สูง ใช้สำหรับการทำความสะอาด Matrix ที่มีฟอสโฟลิพิดสูงเป็นประจำ หรือใช้เป็นขั้นตอนขัดเงา (polishing) หลังจากทำ HLB SPE เพื่อให้ Baseline สะอาดที่สุด

สำหรับการเปรียบเทียบหลักการออกแบบระบบ LC และ HPLC ที่มีอิทธิพลต่อความทนทานของ Matrix ต่อวิธีการวิเคราะห์ โปรดดูบทความ Liquid Chromatography (LC) vs HPLC: Key Differences, Principles, and Applications

จับคู่ความแรงของตัวทำละลายตัวอย่างกับเฟสเคลื่อนที่

แม้ตัวอย่างจะสะอาดแค่ไหน แต่หากตัวทำละลายในตัวอย่าง (diluent) มีความแรงเกินไปเมื่อเทียบกับเฟสเคลื่อนที่เริ่มต้น ก็อาจทำให้พีกบิดเบี้ยวได้ การฉีดตัวอย่างที่มีสารอินทรีย์สูงลงในคอลัมน์ Reversed-phase ที่ปรับสมดุลไว้ที่ acetonitrile 5% จะทำให้สารวิเคราะห์แยกตัวออกก่อนที่จะโฟกัสพีก ส่งผลให้พีกเกิดอาการหน้าเบ้ (fronting), แยกพีก (splitting) หรือพีกกว้าง

หลักการปฏิบัติคือควรคุมปริมาณสารอินทรีย์ในตัวทำละลายตัวอย่างให้อยู่ภายใน 10% ของสภาวะเริ่มต้นของการรัน หากวิธีเริ่มต้นที่ acetonitrile 5% ตัวทำละลายตัวอย่างไม่ควรมี acetonitrile มากกว่า 15% หากตัวทำละลายที่ใช้ชะจาก SPE แรงเกินไป ให้ระเหยและละลายใหม่

ปรับ pH และความเข้มข้นของบัฟเฟอร์ให้ตรงกับที่ใช้ในเฟสเคลื่อนที่ ความเข้มข้นของเกลือที่ไม่ตรงกันเมื่อฉีดตัวอย่างจะทำให้เกิดขั้นบันไดบน Baseline และการเลื่อนของเวลาที่สารผ่านคอลัมน์ (retention time) โดยเฉพาะในวิธีที่ใช้การจับคู่ไอออนหรือการแลกเปลี่ยนไอออน ควรไล่ก๊าซในตัวอย่างที่เตรียมเสร็จแล้วหากมีการนำมาละลายใหม่หรือผ่านการใช้คลื่นเสียง

หลังจากเจือจางหรือเติมสารปรับปรุงใดๆ ให้ตรวจสอบสารละลายด้วยสายตา หากเกิดการตกตะกอน ให้กรองตัวอย่างผ่าน Millex® Syringe Filter อีกครั้งก่อนนำเข้า Autosampler ขั้นตอนนี้ทำได้รวดเร็วและช่วยหลีกเลี่ยงการฉีดวัสดุที่จะทำให้ Frit อุดตัน

การใช้ตัวทำละลาย TCI HPLC/UHPLC เกรด LC หรือ LC-MS สำหรับทั้งการละลายใหม่และการเตรียมเฟสเคลื่อนที่ ช่วยให้พื้นหลังมีความสม่ำเสมอในทุกขั้นตอน การเปลี่ยนเกรดตัวทำละลายระหว่างการวิเคราะห์จะทำให้ค่าดูดกลืนแสง UV เปลี่ยนแปลงและความไม่เสถียรของ Baseline ซึ่งตรวจติดตามได้ยาก การจับคู่ตัวทำละลายเป็นส่วนหนึ่งของการ เตรียมตัวอย่าง HPLC เพื่อลดปัญหาคอลัมน์ ซึ่งจะป้องกันการตกตะกอนในคอลัมน์และช่วยรักษาคุณภาพพีกตลอดการรัน

เคล็ดลับและข้อควรระวังเพื่อโครมาโทแกรมที่สะอาด

ความคงตัวของตัวอย่างหลังเตรียมเป็นข้อควรคำนึงในทางปฏิบัติที่มักถูกมองข้ามจนกว่าผลวิเคราะห์จะต่างกันในคิวของ Autosampler ตัวอย่างส่วนใหญ่ที่ตกตะกอนโปรตีนและผ่านการทำความสะอาดด้วย SPE จะมีความคงตัวทางเคมีวิเคราะห์นาน 24 ถึง 48 ชั่วโมงที่ 4°C สำหรับการรันข้ามคืนหรือหลายวัน ให้ยืนยันข้อมูลความคงตัวสำหรับสารของคุณก่อน การแช่แข็งที่ -20°C เหมาะสำหรับการเก็บเกิน 48 ชั่วโมง และควรหลีกเลี่ยงการผ่านรอบการแช่แข็ง-ละลายเกินสองครั้ง

การแก้ปัญหาความล้มเหลวในการเตรียมตัวอย่าง HPLC

ปัญหาที่ปรากฏที่เครื่องตรวจวัดหรือระบบตรวจสอบความดันส่วนใหญ่มักมีสาเหตุจากขั้นตอนใดขั้นตอนหนึ่งในการเตรียมตัวอย่าง ใช้ตารางด้านล่างเพื่อระบุสาเหตุและใช้วิธีแก้ไขที่ตรงจุดแทนที่จะรันตัวอย่างใหม่ทั้งชุด

หลังจากการเปลี่ยนแปลงขั้นตอนการเตรียม ให้รันตัวอย่างทดสอบที่ทำจาก Matrix เดียวกันก่อนประมวลผลทั้งชุด ตรวจสอบให้มั่นใจว่าความดันคงที่และ Baseline ราบเรียบก่อนดำเนินการ ขั้นตอนการตรวจสอบนี้ช่วยป้องกันความล้มเหลวซ้ำซ้อนและประหยัดอายุคอลัมน์ของคุณ

คำถามที่พบบ่อย