วิธีสังเคราะห์เปปไทด์ด้วย Fmoc SPPS: โปรโตคอลทีละขั้นตอน

ลำดับเปปไทด์ที่ขาดหายไป การเกิด aspartimide และพีกที่กว้างใน HPLC มักมีสาเหตุมาจากการได้รับความชื้น การทำ deprotection มากเกินไป หรือการทำ coupling ที่เร่งรีบเกินไป โปรโตคอลการสังเคราะห์เปปไทด์ด้วย Fmoc SPPS ที่ได้มาตรฐานจะช่วยแก้ไขปัญหาเหล่านี้ได้ด้วยการกำหนดปริมาตร เวลา และจุดตรวจสอบคุณภาพ (QC) ก่อนที่คุณจะเริ่มเติมเรซิน ตามคำแนะนำนี้เพื่อตั้งค่า ดำเนินการ ทำ cleavage และตรวจสอบคุณภาพงานการสังเคราะห์เปปไทด์ด้วย Fmoc SPPS อย่างมั่นใจทั้งบนแพลตฟอร์มแบบตั้งโต๊ะและระบบอัตโนมัติ

เหตุใดโปรโตคอลการสังเคราะห์เปปไทด์ Fmoc SPPS นี้จึงมีความสำคัญ

Fmoc SPPS ช่วยให้เข้าถึงเปปไทด์สายตรง (linear peptides) เปปไทด์สายพันธุ์ต่างๆ และ isotopologues ได้อย่างรวดเร็วในระดับ 0.01 ถึง 1 mmol ด้วยเวลาในแต่ละรอบที่คาดการณ์ได้ ไม่มีวิธีการในระดับห้องปฏิบัติการอื่นใดที่เทียบเท่ากับความเร็วและความยืดหยุ่นของลำดับเช่นนี้ได้ อย่างไรก็ตาม ข้อได้เปรียบเหล่านั้นจะหายไปเมื่อการทำ coupling ไม่สมบูรณ์ การเกิดปฏิกิริยาข้างเคียงจากเบส และการล้างที่ไม่มีประสิทธิภาพส่งผลให้ความบริสุทธิ์ต่ำกว่าเกณฑ์ที่ยอมรับได้

คำแนะนำนี้มุ่งเน้นไปที่ปัจจัยหลักสามประการที่ทำให้การสังเคราะห์ล้มเหลวโดยตรง ปริมาตรการล้างที่ได้มาตรฐานจะช่วยลดการอัดตัวของเรซิน ขั้นตอนการทำ deprotection ที่จับเวลาอย่างแม่นยำจะจำกัดการสัมผัสกับเบส และการทดสอบ colorimetric ที่รวดเร็วจะช่วยตรวจจับปฏิกิริยาที่ไม่สมบูรณ์ก่อนที่ความผิดพลาดจะสะสมในแต่ละรอบการสังเคราะห์

บูรณาการ Kaiser test หรือ chloranil test ในทุกขั้นตอนการ coupling ยืนยันเอกลักษณ์ด้วย LC-MS และความบริสุทธิ์ด้วย RP-HPLC พารามิเตอร์ที่ระบุนี้นำไปใช้กับเครื่องปฏิกรณ์แบบเข็มฉีดยาด้วยตนเองได้ และยังปรับใช้กับเครื่องสังเคราะห์อัตโนมัติส่วนใหญ่ได้โดยตรง

สิ่งที่คุณต้องเตรียม: อุปกรณ์ สารเคมี และอุปกรณ์ความปลอดภัย

อุปกรณ์

คุณต้องมีเครื่องปฏิกรณ์สำหรับเปปไทด์แบบแมนนวลหรือเครื่องสังเคราะห์อัตโนมัติ สายไนโตรเจนหรืออาร์กอน เครื่องเขย่าแบบ orbital ท่อรวมสุญญากาศ และเครื่องเหวี่ยงหนีศูนย์ ในขั้นตอนถัดไป คุณต้องมีเครื่องทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง (lyophilizer) ระบบ RP-HPLC สำหรับวิเคราะห์ และการเข้าถึง LC-MS เพื่อยืนยันเอกลักษณ์ อ่างความเย็นและตู้ดูดควันที่มีมาตรฐานเป็นสิ่งที่ขาดไม่ได้สำหรับการทำงานกับสาร cleavage

สารเคมีและเรซิน

ชุดสารเคมีหลักประกอบด้วยกรดอะมิโนที่ป้องกันด้วยหมู่ Fmoc, สารช่วย coupling (HBTU, HATU หรือ DIC ร่วมกับ Oxyma Pure), เบส (DIPEA), เบสสำหรับการทำ deprotection (piperidine) และส่วนประกอบของ cleavage cocktail (TFA, TIPS, น้ำ) การใช้สารเคมีจากซัพพลายเออร์ที่ผ่านการรับรองช่วยประหยัดเวลาในการแก้ปัญหาปฏิกิริยาข้างเคียง Merck/Sigma-Aldrich และ TCI มีแคตตาล็อกสารอนุพันธ์ Fmoc amino acid ที่ครอบคลุม รวมถึงกรดอะมิโนที่ไม่เป็นไปตามธรรมชาติ (unnatural amino acid) เช่น N-methyl amino acids, beta-branched residues และ homo-amino acids สำหรับการทำงานกับลำดับเปปไทด์ที่ไม่เป็นมาตรฐาน

สำหรับการยืนยันเอกลักษณ์ของกรดอะมิโนระหว่างการพัฒนาวิธีการ Merck certified amino acid reference materials ให้มาตรฐานที่ตรวจสอบย้อนกลับได้สำหรับการวิเคราะห์ GC/MS และ LC/MS ซึ่งช่วยให้ผลงาน QC ของคุณอ้างอิงกับค่าที่เป็นที่ยอมรับได้

การควบคุมความชื้น: ใช้ DMF เกรด anhydrous จากขวดที่เปิดใหม่หรือสต็อกที่ผ่านการอบแห้งด้วย molecular sieve เก็บสายจ่ายตัวทำละลายภายใต้ก๊าซเฉื่อยตลอดเวลา อบเครื่องแก้วที่ 120°C ข้ามคืนก่อนใช้งาน DMF ที่มีความชื้นเป็นหนึ่งในสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดที่ทำให้ coupling เกิดความล่าช้า

ตัวทำละลายและวัสดุสิ้นเปลือง

สำรอง anhydrous DMF, DCM, methanol หรือ IPA และ diethyl ether ใช้เข็มฉีดยา polypropylene แบบมีฟริตหรือเครื่องปฏิกรณ์ที่มีขนาดเหมาะสมกับสเกลของคุณ เตรียมตัวกรอง 0.22 µm PTFE, เข็มฉีดยาแบบใช้แล้วทิ้ง และสาย PTFE ให้พร้อมก่อนเริ่มงาน การที่วัสดุสิ้นเปลืองหมดกลางคันจะรบกวนเวลาและเสี่ยงต่อการที่เรซินแห้ง

ตารางอ้างอิงวัสดุ

หมวดหมู่	รายการ	เกรด / ข้อมูลจำเพาะ	การเก็บรักษา
Fmoc Amino Acids	Fmoc-AA-OH (มาตรฐานและไม่เป็นธรรมชาติ)	Peptide synthesis grade, >98%	-20°C, ในโถดูดความชื้น, ภายใต้ Ar
Coupling Agents	HBTU, HATU, DIC, Oxyma Pure	Reagent grade, ชั่งน้ำหนักใหม่ทุกครั้ง	4°C, ในโถดูดความชื้น
Base	DIPEA (Hünig's base)	Anhydrous, >99%	RT, ปิดสนิท, บรรยากาศก๊าซเฉื่อย
Deprotection	Piperidine ใน DMF (20% v/v)	เตรียมใหม่ทุกวัน	ใช้ภายใน 48 ชั่วโมง
Cleavage	TFA, TIPS, น้ำ, สารกำจัดสิ่งเจือปน	Peptide cleavage grade	ตู้ดูดควัน; TFA ปิดสนิทที่ RT
Solvents	Anhydrous DMF, DCM, MeOH, Et₂O	Anhydrous หรือ HPLC grade	Molecular sieves; ภายใต้ N₂
Resin	Rink Amide, Wang, 2-chlorotrityl	ตามข้อมูลผู้ผลิต	4°C, แห้ง, ปิดสนิท
QC Standards	กรดอะมิโนหรือเปปไทด์ขนาดเล็ก	Certified reference material	ตาม CoA ของผู้ผลิต

การทำ Swelling เรซินและกำหนดจุด C-Terminus

การเลือกเรซิน

เลือกเรซินก่อนทำการคำนวณสเกล เรซินแต่ละชนิดจะเป็นตัวกำหนดฟังก์ชันที่ C-terminus และตั้งค่าสภาวะ cleavage ที่ยอมรับได้สำหรับการสังเคราะห์ทั้งหมด

คู่มือตัดสินใจเลือกเรซิน

Rink Amide Resin

ผลิตภัณฑ์ C-terminal amide หลัง cleavage ด้วย TFA
เปปไทด์มาตรฐาน, therapeutic mimetics
รับโหลดได้ดี; มีจำหน่ายแพร่หลายในหลายความจุ

Wang Resin

ผลิตภัณฑ์ C-terminal free acid
เปปไทด์วิจัยที่ต้องการ carboxylate terminus
ต้องการสภาวะ TFA ที่รุนแรงกว่า Rink

2-Chlorotrityl Resin

C-terminal acid; cleavage แบบอ่อนมาก (1% TFA หรือ AcOH/TFE/DCM)
ลำดับที่ไวต่อกรด, การประกอบชิ้นส่วน (fragment assembly)
จับยึดแฟรกเมนต์โดยที่ side chain ยังคงถูกป้องกัน

เคล็ดลับการโหลด: อย่าเกิน 0.2 ถึง 0.3 mmol/g สำหรับลำดับที่มีแนวโน้มรวมตัวกัน (aggregation-prone) หรือไม่ชอบน้ำ การโหลดในปริมาณที่ต่ำกว่าช่วยลดการสัมผัสระหว่างสายโซ่และปรับปรุงประสิทธิภาพการ coupling ในแต่ละรอบ

โปรโตคอลการทำ Swelling

คำนวณสเกล: สำหรับการสังเคราะห์ 0.1 mmol ที่การโหลด 0.5 mmol/g ให้ชั่งเรซิน 200 mg ลงในเครื่องปฏิกรณ์
เติม DCM (5 ถึง 10 mL ต่อเรซิน 1 กรัม) ปล่อยให้เรซินบวม 20 ถึง 30 นาทีโดยเขย่าเบาๆ ภายใต้ก๊าซเฉื่อย
ถ่าย DCM ออกให้หมดผ่านสุญญากาศหรือแรงดันไนโตรเจนเบาๆ
เติม anhydrous DMF ในอัตราส่วนปริมาตรเดียวกัน เขย่า 20 ถึง 30 นาทีเพื่อให้การแลกเปลี่ยนตัวทำละลายสมบูรณ์
ถ่าย DMF ออก เรซินพร้อมแล้วสำหรับการทำ deprotection หรือการโหลดกรดอะมิโนขั้นตอนแรก
หากใช้เรซินที่ติด Fmoc มาก่อน ให้ไปยังขั้นตอนการกำจัด Fmoc หากทำการโหลดบน 2-chlorotrityl ให้ทำตามโปรโตคอลของผู้ผลิตและ cap ตำแหน่งที่เหลือด้วย methanol/DIPEA/DCM (1:0.1:9) เป็นเวลา 15 นาทีก่อนดำเนินการต่อ

ประเภทเรซิน	Linker	C Terminus หลัง Cleavage	ความแรงของ Cleavage	การใช้งานหลัก
Rink Amide	Rink amide linker	-NH₂	TFA ปานกลาง (95%)	เปปไทด์ amide มาตรฐาน
Wang	4-hydroxybenzyl alcohol	-COOH	TFA แรง (>90%)	เปปไทด์ free acid
2-Chlorotrityl	Trityl-based	-COOH (side chains ยังคงป้องกัน)	อ่อนมาก (1% TFA หรือ cocktail AcOH)	ไวต่อกรด; การสังเคราะห์แฟรกเมนต์

การกำจัด Fmoc, การทำ Coupling และการ Capping

รอบการสังเคราะห์แต่ละรอบในโปรโตคอลการสังเคราะห์เปปไทด์ด้วย Fmoc SPPS นี้ประกอบด้วยขั้นตอนย่อย 3 ขั้นตอน: การกำจัด Fmoc, การกระตุ้นและการทำ coupling กรดอะมิโน และการทำ capping การปฏิบัติตามเวลาและปริมาตรที่กำหนดอย่างเคร่งครัดคือสิ่งที่แยกเปปไทด์ดิบที่สะอาดออกจากงานการทำให้บริสุทธิ์ที่ยากลำบาก

การกำจัด Fmoc และการล้าง

เตรียม 20% piperidine ใน anhydrous DMF ใหม่ในวันที่ใช้งาน
เติมสารละลาย deprotection ลงในเครื่องปฏิกรณ์ (8 ถึง 10 mL ต่อเรซิน 1 กรัม) เวลาสัมผัส: 3 นาที ถ่ายออก
เติมสารละลาย deprotection อีกครั้งในปริมาตรเท่าเดิม เวลาสัมผัส: 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องโดยมีการเขย่า ถ่ายออกให้หมด
ล้างเรซินด้วย anhydrous DMF, 5 ครั้ง ครั้งละ 1 นาที ถ่ายออกให้หมดระหว่างการล้าง
ทางเลือก: เก็บ filtrate ที่ได้จากการ deprotection และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 301 nm เพื่อหาปริมาณ dibenzofulvene-piperidine adduct และคำนวณ yield ของ coupling จากรอบที่ผ่านมา
ทำ Kaiser test กับเรซินตัวอย่างขนาดเล็ก สีน้ำเงินยืนยันถึงการมี free amines และการกำจัด Fmoc ที่สำเร็จ ดำเนินการขั้นตอน coupling ต่อไป

ความเสี่ยงต่อ Aspartimide: การสัมผัส piperidine นานเกินไปกับ Asp residues ส่งผลให้เกิดการก่อตัวของ aspartimide ซึ่งทำให้เกิดผลพลอยได้ที่แยกออกยาก ให้รักษาเวลาการทำ deprotection ไว้ที่ 3 + 10 นาที หลีกเลี่ยงความร้อน สำหรับส่วนที่มี Asp สูง ให้พิจารณาเปลี่ยน piperidine มาตรฐานด้วย 2% DBU ร่วมกับ 2% piperazine ใน DMF หรือเติม 0.1 M Oxyma ลงในสารละลาย deprotection เพื่อยับยั้งปฏิกิริยาข้างเคียง

การกระตุ้นและการทำ Coupling กรดอะมิโน

ชั่งกรดอะมิโนที่ป้องกันด้วย Fmoc (4.0 equivalents ต่อสเกล 0.1 mmol = 0.4 mmol), สาร coupling HBTU หรือ HATU (3.8 ถึง 4.0 equivalents) และ DIPEA (8.0 equivalents)
ละลายใน anhydrous DMF ให้มีความเข้มข้นกรดอะมิโนประมาณ 0.2 M กระตุ้นล่วงหน้า 1 ถึง 2 นาทีในขวดก่อนเติมลงในเรซิน
ถ่ายสารละลายที่กระตุ้นแล้วลงในเครื่องปฏิกรณ์ ทำปฏิกิริยา 30 ถึง 60 นาทีที่ 20 ถึง 25°C โดยเขย่าต่อเนื่องภายใต้ก๊าซเฉื่อย
ถ่ายสารละลาย coupling ออก ทำ Kaiser test เรซินที่ไม่มีสีแสดงถึงการทำ coupling ที่สมบูรณ์
สำหรับการทำ coupling ที่ยาก (Kaiser ให้ผลเป็นบวกหลังทำครั้งเดียว): ทำ coupling ซ้ำอีกครั้งโดยใช้สารที่กระตุ้นใหม่ หรือเปลี่ยนไปใช้ DIC (4.0 equivalents) ร่วมกับ Oxyma Pure (4.0 equivalents) ใน DMF เพื่อลดการสะสมของผลพลอยได้ guanidinium เพิ่มเวลาปฏิกิริยาเป็น 90 นาที
สำหรับ residue ที่มีความเทอะทะ (Aib, N-methyl amino acids, beta-branched เช่น Ile หรือ Val): สามารถให้ความร้อนอ่อนๆ ที่ 50°C ได้หากเครื่องปฏิกรณ์ของคุณรองรับอุณหภูมิที่ควบคุมได้

Chloranil test สำหรับ secondary amines: ใช้ chloranil test แทน Kaiser สำหรับ N-methyl amino acids และ proline เนื่องจาก Kaiser ให้ผลลบปลอมสำหรับ secondary amines สีน้ำเงินเขียวบ่งชี้ว่า coupling ที่ตำแหน่งเหล่านั้นไม่สมบูรณ์

การทำ Capping และการล้างขั้นสุดท้าย

เตรียมสารผสม capping: 5% acetic anhydride ร่วมกับ 5% DIPEA ใน anhydrous DMF
เติมสารละลาย capping ลงในเครื่องปฏิกรณ์ (8 ถึง 10 mL ต่อเรซิน 1 กรัม) ทำปฏิกิริยา 5 ถึง 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ขั้นตอนนี้ช่วยปิด amine ที่ไม่ทำปฏิกิริยาเพื่อป้องกันการสะสมของลำดับที่ขาดหายไป
ถ่ายสารละลาย capping ออก ล้างด้วย DMF 3 ถึง 5 ครั้ง โดยแช่ครั้งละ 1 นาที ถ่ายสารล้างออกให้หมดทุกครั้ง
ล้างด้วย DCM 3 ครั้งเพื่อกำจัดคราบ DMF และทำให้เรซินยุบตัวลงเล็กน้อยสำหรับขั้นตอน deprotection ต่อไป
บันทึกค่า equivalents, ปริมาตร, อุณหภูมิ และเวลาของทุก residue บันทึกนี้คือแหล่งข้อมูลสำคัญในการแก้ปัญหาหากความบริสุทธิ์ลดลง

ขั้นตอน	รีเอเจนต์ / สารละลาย	ปริมาตร (ต่อเรซิน 1 กรัม)	อุณหภูมิ	เวลา	เกณฑ์การผ่าน
Deprotection 1	20% piperidine/DMF	8-10 mL	RT	3 นาที	ถ่ายออกให้หมด
Deprotection 2	20% piperidine/DMF	8-10 mL	RT	10 นาที	Kaiser น้ำเงิน = ยืนยัน amine อิสระ
ล้างด้วย DMF	Anhydrous DMF	8-10 mL × 5	RT	1 นาที/ครั้ง	ถ่ายออกให้ใส
Coupling	Fmoc-AA + HBTU/HATU + DIPEA (0.2 M)	5 mL	20-25°C	30-60 นาที	Kaiser ไร้สี = สมบูรณ์
Recoupling (ถ้าจำเป็น)	DIC + Oxyma, สารใหม่	5 mL	20-25°C	30-90 นาที	Kaiser ไร้สีหลังทดสอบรอบสอง
Capping	Ac₂O 5% + DIPEA 5% / DMF	8-10 mL	RT	5-10 นาที	ไม่พบสัญญาณ amine
ล้างด้วย DMF	Anhydrous DMF	8-10 mL × 3-5	RT	1 นาที/ครั้ง	ถ่ายออกให้ใส
ล้างด้วย DCM	DCM	8-10 mL × 3	RT	1 นาที/ครั้ง	พร้อมสำหรับ deprotection รอบถัดไป

การทำ Cleavage, การตกตะกอน และการกำจัดเกลือ

การกำจัดหมู่ป้องกัน Side Chain และการทำ Cleavage

เตรียม cleavage cocktail: TFA/TIPS/น้ำ ในอัตราส่วน 95:2.5:2.5 (v/v/v) สำหรับลำดับที่มี Cys หรือ Met ให้ปรับสาร scavengers (เช่น เติม 2.5% EDT และลดน้ำลงตามสัดส่วน)
ถ่ายสารจากเรซินออกให้หมดหลังรอบการล้างสุดท้าย เติม cleavage cocktail ลงบนเรซินโดยตรง (ประมาณ 1 mL ต่อเรซิน 100 mg)
กวนเบาๆ ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ถึง 3 ชั่วโมง สังเกตการเปลี่ยนสีซึ่งบ่งบอกถึงการละลายของเรซินหากใช้ linker ชนิด trityl
กรองส่วนผสมผ่านเข็มฉีดยาที่มีฟริตเพื่อเก็บ filtrate ล้างเรซินด้วย TFA ปริมาณเล็กน้อย (2 × 0.5 mL ต่อเรซิน 100 mg) และรวม filtrate เข้าด้วยกัน
ค่อยๆ หยด filtrate ที่รวมแล้วลงใน diethyl ether เย็นจัด 10 เท่าของปริมาตร เปปไทด์จะตกตะกอนเป็นของแข็งสีขาวหรือขาวนวล
เหวี่ยงหนีศูนย์ที่ 3000 ถึง 4000 × g เป็นเวลา 5 นาที ทิ้งส่วนใส (supernatant) ลงในภาชนะทิ้งขยะ TFA โดยเฉพาะในตู้ดูดควันอย่างระมัดระวัง
นำก้อนตะกอน (pellet) ไปละลายใน ether เย็น เหวี่ยงและทิ้งส่วนใส ทำซ้ำ 2 ถึง 3 ครั้งเพื่อกำจัด TFA และคราบ scavengers
เป่าก้อนตะกอนให้แห้งด้วยกระแสไนโตรเจน จากนั้นอบภายใต้สุญญากาศ 30 นาที ชั่งน้ำหนักเปปไทด์ดิบ
ละลายในน้ำ/acetonitrile ที่มี 0.1% formic acid (ปรับอัตราส่วนตามการละลายของเปปไทด์) กรองผ่านตัวกรอง 0.22 µm ก่อนฉีดเข้าเครื่อง

ห้ามทิ้งเปปไทด์ใน TFA นาน: TFA ทำให้เกิดปฏิกิริยาข้างเคียงต่อเนื่องและการเกิด Met oxidation เมื่อสัมผัสเป็นเวลานาน ดำเนินการตกตะกอนภายใน 10 นาทีหลังจากกรองออกจากเรซิน

การกำจัดเกลือและการวิเคราะห์ด้วย HPLC

การทำ desalting ด้วย C18 SPE cartridge ก่อนการทำ preparative HPLC จะช่วยลดภาระของเกลือ TFA และทำให้ baseline แคบลง โหลดตัวอย่างใน 0.1% TFA/น้ำ ล้างด้วย 5% acetonitrile/น้ำ และชะออกมา (elute) ด้วย 60 ถึง 80% acetonitrile/น้ำ

สำหรับการวิเคราะห์ QC ให้รัน RP-HPLC ก่อนตัดสินใจฉีดสารเพื่อเตรียมเปปไทด์ในปริมาณมาก คอลัมน์ C18 หรือ C8 รูพรุนกว้าง (wide-pore) ที่ออกแบบมาสำหรับเปปไทด์ให้ความละเอียดที่คมชัดที่สุดสำหรับเปปไทด์สายตรงขนาดกลาง สำหรับการตั้งค่าวิธีการบนคอลัมน์เปปไทด์รูพรุนกว้าง คู่มือ BIOshell A160 Peptide U/HPLC column จาก Merck ครอบคลุมเรื่อง gradient, อัตราการไหล และพารามิเตอร์การตรวจวัดอย่างละเอียด

ก่อนฉีดสารดิบ ให้รัน dipeptide หรือ tripeptide reference standards เพื่อตรวจสอบความเหมาะสมของระบบ (system suitability) retention time และรูปร่างของพีกที่สม่ำเสมอจะยืนยันว่า gradient และคอลัมน์ทำงานถูกต้อง ก่อนที่คุณจะเสี่ยงกับตัวอย่างดิบที่มีค่าของคุณ

พารามิเตอร์	การตั้งค่าทั่วไป
คอลัมน์	C18, รูพรุน 160-300 Å, ID 2.1-4.6 mm
Mobile Phase A	0.1% TFA ในน้ำ
Mobile Phase B	0.1% TFA ใน acetonitrile
Gradient	5% ถึง 65% B ใน 20 นาที (scout gradient)
อัตราการไหล	0.5-1.0 mL/min (analytical); ปรับสเกลขึ้นสำหรับการเตรียม
การตรวจวัด	214 nm หรือ 220 nm
ปริมาตรการฉีด	1-5 µg สำหรับวิเคราะห์; ปรับตามความจุคอลัมน์สำหรับการเตรียม

เคล็ดลับ บันทึกความปลอดภัย และจุดตรวจสอบคุณภาพ

การใช้โปรโตคอลการสังเคราะห์เปปไทด์ด้วย Fmoc SPPS ที่สม่ำเสมอในทุกรอบการผลิตจะคุ้มค่าเมื่อความปลอดภัยและความสมบูรณ์ของรีเอเจนต์ได้รับการรักษาควบคู่ไปกับความแม่นยำของลำดับ

ความปลอดภัย: TFA และ piperidine ทำงานในตู้ดูดควันที่มีมาตรฐานเท่านั้น สวมแว่นตานิรภัยและถุงมือทนกรด จัดเตรียมภาชนะทิ้งขยะที่ระบุฉลากและปิดสนิทก่อนเปิด TFA ไอระเหยของ piperidine มีความเป็นพิษเฉียบพลัน; ปิดฝาสารละลายทุกครั้งหลังใช้งาน

ความเสถียรและการเก็บรักษารีเอเจนต์

เก็บกรดอะมิโน Fmoc และตัวกระตุ้นในที่แห้งที่ -20°C ภายใต้อาร์กอน สารละลาย piperidine ใน DMF จะเสื่อมสภาพภายใน 48 ชั่วโมง; เตรียมใหม่ทุกวัน เปลี่ยน DMF เมื่อมีสีเข้มขึ้นหรือเมื่อขั้นตอนการ deprotection เริ่มช้าลงอย่างเห็นได้ชัด การเปลี่ยนสีมักบ่งชี้ถึงการปนเปื้อนของ amine หรือการดูดความชื้น

เปปไทด์ที่เป็นซับสเตรตเอนไซม์มักมีการเติมหมู่ฟอสเฟต, อะเซทิล หรือการดัดแปรอื่นๆ ที่ไม่เสถียร ใช้ cleavage cocktail ที่อ่อนโยนกว่าและทำให้สารเป็นกลางหรือแช่แข็งทันทีหลังการตกตะกอนเพื่อรักษาการดัดแปรเหล่านั้นไว้

การควบคุมการรวมตัวของเปปไทด์ลำดับยาก

ลำดับที่ชอบน้ำน้อย (hydrophobic) และการเรียงตัวของ beta-branched residue ทำให้เกิดการรวมตัวระหว่างสายบนเรซิน ให้ใช้เรซินที่โหลดต่ำ (0.2 ถึง 0.3 mmol/g), ใช้ pseudoproline dipeptide building blocks ที่ตำแหน่ง Ser หรือ Thr หรือกลุ่มป้องกันที่ backbone สำหรับลำดับที่ยาวเกิน 20 residues แคตตาล็อกกรดอะมิโนที่ไม่เป็นไปตามธรรมชาติของ TCI ประกอบด้วย N-methyl amino acids และ building blocks อื่นๆ ที่ปรับเปลี่ยน backbone ซึ่งสามารถทำลายการรวมตัวได้โดยไม่ต้องออกแบบลำดับเป้าหมายใหม่

สำหรับการสร้าง spectra อ้างอิงและการวัด retention เวลาใน HPLC, custom peptide reference standards ช่วยให้คุณตรวจสอบความถูกต้องของ gradient ใหม่หรือยืนยันเอกลักษณ์เทียบกับตัวอย่างที่ทราบค่า ก่อนเริ่มรันเตรียมสารเต็มรูปแบบ

เคล็ดลับฉบับย่อ

ให้ไนโตรเจนไหลผ่านเรซินตลอดเวลา แม้ในระหว่างหยุดพักช่วงสั้นๆ ระหว่างรอบ
ใช้ตัวทำละลาย 8 ถึง 10 mL ต่อเรซิน 1 กรัมในการล้างทุกครั้ง ปริมาตรน้อยเกินไปทำให้เรซินอัดตัวและดักรีเอเจนต์ไว้
บันทึกทุกรอบ: residue, equivalents ที่ใช้, เวลา coupling และผล Kaiser การขาดหายไปของบันทึกคือสัญญาณของความไม่บริสุทธิ์
ทำ Kaiser และ chloranil test ในทุก coupling อย่าทึกทักเอาเองว่าเคมีสะอาด ต้องยืนยันผลเสมอ
รัน scout gradient (5% ถึง 65% B, 20 นาที) กับเปปไทด์ดิบก่อนพัฒนากรรมวิธี preparative
เปลี่ยนสารละลาย piperidine/DMF หากขั้นตอน deprotection นานผิดปกติ รีเอเจนต์อาจเสื่อมสภาพแล้ว
แช่เย็นขวดตกตะกอน ether ในอ่างน้ำแข็งก่อนเติม TFA filtrate การตกตะกอนอย่างช้าๆ จะทำให้ได้อนุภาคขนาดใหญ่ขึ้นและเก็บเป็นก้อน (pellet) ได้ง่ายกว่า
แช่แข็งสารละลายเปปไทด์ดิบที่ -20°C หากยังไม่สามารถเริ่มการทำให้บริสุทธิ์ภายใน 24 ชั่วโมง

การแก้ปัญหาทั่วไปของ SPPS

ปัญหา	สาเหตุที่เป็นไปได้	วิธีแก้ไข
Kaiser เป็นบวกหลัง coupling มาตรฐาน	Coupling ไม่สมบูรณ์; equivalents ของรีเอเจนต์ต่ำ หรือ DMF มีความชื้น	เติมสารกระตุ้นใหม่ (DIC + Oxyma, 4 eq) และเพิ่มเวลาเป็น 60-90 นาที; ตรวจสอบว่า DMF เป็น anhydrous
Kaiser ยังคงเป็นบวกหลังทำซ้ำ	การรวมตัวของเรซิน; ความเทอะทะที่ beta-branched หรือ N-methyl residue	เปลี่ยนไปใช้ pseudoproline หรือลดการโหลดเรซินเป็น 0.2 mmol/g; ลองให้ความร้อนอ่อนๆ ที่ 50°C เป็นเวลา 30 นาทีภายใต้ไนโตรเจน
พีกจากสารข้างเคียง Aspartimide ใน HPLC	สัมผัสเบสนานเกินไปขณะทำ deprotection ที่ Asp residues	เปลี่ยนไปใช้ 2% DBU + 2% piperazine ใน DMF หรือเติม 0.1 M Oxyma ลงใน piperidine; รักษา deprotection ไว้ที่ 3 + 10 นาที, ห้ามให้ความร้อน
ผลผลิต cleavage ต่ำ; เปปไทด์ยังติดอยู่บนเรซิน	TFA สัมผัสเวลาน้อยเกินไป หรือสาร scavengers ไม่เพียงพอ	ขยายเวลา cleavage เป็น 3 ชั่วโมง; เพิ่ม scavenger ที่เหมาะสม (EDT สำหรับ Cys/Met); ตรวจสอบว่าเรซินถูกถ่ายออกจนแห้งก่อนเติม cocktail
เปปไทด์ไม่ตกตะกอนใน ether	มีน้ำหรือ acetonitrile มากเกินไป; ลำดับมีคุณสมบัติ hydrophilic มากเกินไป	เติม ether เย็นจัดเพิ่มขึ้น (สูงสุด 20 เท่า); แช่เย็นส่วนผสมเพิ่ม; สำหรับเปปไทด์ที่มี hydrophilic มาก ให้ระเหย TFA ออกบางส่วนภายใต้ไนโตรเจนก่อนตกตะกอน
ความบริสุทธิ์ HPLC ต่ำ; พีกกว้างหรือมีหลายพีก	ลำดับขาดหายจากการ coupling ไม่สำเร็จ; หรือขนาดรูพรุนคอลัมน์ไม่เหมาะกับ MW	ทบทวนบันทึกรอบ; เปลี่ยนไปใช้คอลัมน์รูพรุนกว้าง (160-300 Å); ปรับปรุง gradient ใหม่โดยลด slope ให้แบนลง (0.5% B/min) รอบพีกหลัก

การปฏิบัติตามโปรโตคอลนี้อย่างสม่ำเสมอ

ทุกส่วนของขั้นตอนการทำงานนี้ ตั้งแต่การ swelling เรซินไปจนถึง cleavage และ QC ถูกออกแบบมาเพื่อขจัดตัวแปรที่ทำให้เปปไทด์ไม่บริสุทธิ์ ปริมาตรการล้างที่เป็นมาตรฐาน การจับเวลา deprotection และการตรวจสอบสีหลังทุกขั้นตอนการ coupling จะช่วยให้คุณมีบันทึกที่น่าเชื่อถือสำหรับการสร้างงานแต่ละครั้ง

ใช้ตารางบันทึกรอบการสังเคราะห์กับทุกรัน เมื่อความบริสุทธิ์ของ HPLC ลดลง บันทึกจะบอกคุณว่าควรตรวจสอบ residue ใดก่อน ความรวดเร็วในการวินิจฉัยนี้มีค่ามากกว่าการอัปเกรดรีเอเจนต์ใดๆ

การสังเคราะห์เปปไทด์เป็นงานที่ต้องทำซ้ำและปรับปรุง การสังเคราะห์ครั้งแรกของลำดับใหม่มักไม่ให้ความบริสุทธิ์เท่ากับครั้งที่ห้า ใช้ตารางการแก้ปัญหาเพื่อปิดช่องว่างให้เร็วขึ้น และใช้มาตรฐานอ้างอิงที่ผ่านการพิสูจน์แล้วเพื่อยืนยันว่าระบบ HPLC ของคุณทำงานเป็นปกติ ก่อนที่คุณจะแปลความหมายข้อมูลความบริสุทธิ์ดิบ

คำถามที่พบบ่อย

ฉันควรเลือกเรซินชนิดใดสำหรับ C-terminal amide เทียบกับ free acid?

ใช้ Rink Amide resin เมื่อลำดับเป้าหมายต้องการ C-terminal amide หลัง cleavage ด้วย TFA และใช้ Wang resin เมื่อต้องการ carboxylic acid อิสระ เลือก 2-chlorotrityl resin สำหรับลำดับที่ไวต่อกรดหรือการทำ fragment condensation เนื่องจากสามารถปลดปล่อยเปปไทด์ในสภาวะอ่อนมากโดยที่ side chain ยังคงมีหมู่ป้องกันอยู่

ฉันสามารถแทนที่ DIC/Oxyma ด้วย HBTU หรือ HATU ในการ coupling มาตรฐานได้หรือไม่?

ได้ DIC ร่วมกับ Oxyma Pure เป็นทางเลือกที่น่าเชื่อถือ ซึ่งช่วยลดการเกิดผลพลอยได้ guanidinium เมื่อเทียบกับรีเอเจนต์กลุ่ม benzotriazolium ใช้ 3.5 ถึง 4.0 equivalents ของแต่ละตัวเทียบกับปริมาณเรซิน รักษาเวลา coupling ไว้ที่ 30 ถึง 60 นาที และยืนยันความสมบูรณ์ด้วย Kaiser หรือ chloranil test ตามปกติ

เปปไทด์ดิบเก็บไว้ได้นานเท่าใดก่อนทำ purification?

อย่าทิ้งเปปไทด์ไว้ในสารละลาย TFA หลังทำ cleavage ให้ตกตะกอน ล้าง และทำให้ pellet แห้งทันทีที่การกรองเสร็จสิ้น เก็บเปปไทด์ดิบที่ละลายแล้วไว้ที่ 4°C ได้นานถึง 24 ชั่วโมง หรือแช่แข็งที่ -20°C ได้นานหลายวันจนถึงหลายสัปดาห์ สารบางอย่างที่ไวต่อ oxidation (Met, Trp, Cys) อาจต้องเก็บภายใต้อาร์กอนแม้ที่ -20°C

คอลัมน์ HPLC แบบใดที่ทำงานได้ดีที่สุดสำหรับเปปไทด์ QC?

คอลัมน์ reversed-phase แบบรูพรุนกว้างในช่วง 160 ถึง 300 Å ซึ่งมักเป็น C18 ให้ความละเอียดที่ดีที่สุดสำหรับเปปไทด์สายตรงในช่วง 500 ถึง 5000 Da คอลัมน์ที่มี ID 2.1 ถึง 4.6 mm ทำงานได้ดีกับการตรวจวัด UV มาตรฐานที่ 214 หรือ 220 nm ภายใต้ระบบ gradient elution

ฉันควรให้ความร้อนในขั้นตอน deprotection หรือ coupling เพื่อเร่งรอบการทำงานหรือไม่?

หลีกเลี่ยงการให้ความร้อนระหว่าง Fmoc deprotection อุณหภูมิที่สูงขึ้นจะเพิ่มการเกิด aspartimide ที่ Asp residues และเร่งปฏิกิริยาข้างเคียงอื่นๆ ที่เกิดจากเบส การให้ความร้อนอ่อนๆ ที่ 50°C ระหว่าง coupling ของ residue ที่มีความเทอะทะมักเป็นที่ยอมรับ แต่ควรตรวจสอบโดยการรัน test coupling และควบคุมความชื้นอย่างเข้มงวดตลอดกระบวนการ

ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ

ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค

ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express

เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ Peptide Science จาก Merck, TCI และ MedChemExpress (MCE) และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE

ส่งคำถาม เพิ่มเพื่อน LINE