วิธีใช้ Antibody สำหรับ Immunofluorescence (IF): Protocol และการเลือก Conjugate
ปัญหาพื้นหลังสูง (high background), สัญญาณอ่อน, และสัญญาณรบกวนข้ามช่อง (channel bleed-through) มักเกิดจากการเลือกวิธี Fixation ไม่เหมาะสม หรือการทำ antibody immunofluorescence dilution ที่ไม่แม่นยำ นอกจากนี้ ปัญหา Photobleaching มักเกิดขึ้นเมื่อเลือก Conjugate โดยไม่ได้พิจารณาความยาวคลื่นเลเซอร์หรือค่า Autofluorescence ของตัวอย่าง คู่มือฉบับนี้ได้รวบรวม antibody immunofluorescence dilution protocol ที่เชื่อถือได้ กรอบแนวคิดการเลือก Conjugate และตัวควบคุม (controls) ที่จำเป็น เพื่อให้คุณได้ภาพที่คมชัดและสามารถวิเคราะห์เชิงปริมาณได้ตั้งแต่ครั้งแรก
เหตุผลที่การเลือก Antibody และ Conjugate มีความสำคัญต่อ IF
หากเจือจาง (dilute) Primary antibody น้อยเกินไป จะทำให้เกิดสัญญาณพื้นหลังรบกวนภาพจนมองไม่เห็นเป้าหมาย ในทางกลับกัน หากเจือจางมากเกินไปจะทำให้ตรวจไม่พบเป้าหมายที่มีปริมาณน้อย การหาความเข้มข้นที่เหมาะสมเป็นวิธีที่เร็วที่สุดในการเพิ่ม Signal-to-noise ratio ของคุณ
การเลือก Fluorophore ที่ไม่เหมาะสมจะทำให้เกิดปัญหา Spectral overlap ระหว่างช่องสัญญาณ ส่งผลให้เกิด Bleed-through ซึ่งมักเข้าใจผิดว่าเป็น Co-localization การเลือก Conjugate ที่มี Emission spectra แยกจากกันชัดเจนและตรงกับชุด Filter ของเครื่อง จะช่วยป้องกันปัญหานี้ได้ตั้งแต่ต้น
คุณควรใช้ขั้นตอนเหล่านี้ในการทดสอบ Antibody โคลนใหม่ เปลี่ยนวิธีการ Fixation เพิ่มช่องสัญญาณในชุดการทดลองเดิม หรือทำมาตรฐานการทดลองให้สม่ำเสมอทั่วทั้งห้องปฏิบัติการ วิธีนี้ใช้ได้ทั้งกับเซลล์ที่เลี้ยงบน Coverslips และชิ้นเนื้อเยื่อ (Tissue sections) การเข้าใจบทบาทของ Primary antibody ในการจดจำแอนติเจน จะช่วยให้คุณคาดการณ์ได้ว่าการปรับระดับ dilution จะส่งผลกระทบในด้านใดมากที่สุด
ควรใช้ตัวควบคุม 2 ชนิดเสมอ ได้แก่ No-primary control เพื่ออ่านค่า Autofluorescence พื้นฐาน และ Isotype-matched control เพื่อหาค่า Fc binding ที่ไม่จำเพาะเจาะจง ตัวควบคุมเหล่านี้ช่วยให้คุณทราบว่าสัญญาณที่เห็นเป็นของจริงหรือไม่ก่อนที่จะตัดสินใจใช้ความเข้มข้นสุดท้าย
การเลือกสีย้อมที่สว่างและทนต่อแสง (photostable) จะช่วยให้คุณลดกำลังเลเซอร์และระยะเวลาการสแกนลง ซึ่งช่วยรักษาโครงสร้างเซลล์และลด Phototoxicity ในการทดลองกับเซลล์ที่มีชีวิต
อุปกรณ์ สารเคมี และตัวควบคุมที่จำเป็น
อุปกรณ์
คุณต้องมีกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์หรือระบบ Confocal ที่มีชุด Filter ตรงกับ Fluorophore ที่เลือก, ตู้อบความชื้น (humidified incubation chamber), และเครื่องเขย่า (orbital shaker) เพื่อให้แน่ใจว่าการฟักตัวสม่ำเสมอ นอกจากนี้ควรมีตู้เย็นควบคุมอุณหภูมิ, ปิเปตที่ผ่านการสอบเทียบ (calibrated pipettes), และนาฬิกาจับเวลาที่แม่นยำ
สารเคมีและสารละลายบัฟเฟอร์ (Buffers)
เตรียมสารละลายต่อไปนี้ก่อนเริ่มการย้อม:
- Wash buffer: PBS หรือ TBS สำหรับใช้ในทุกขั้นตอนการล้าง
- Fixative: 4% paraformaldehyde (PFA) ใน PBS หรือเมทานอลเย็นจัด
- Permeabilizer: 0.1% Triton X-100 ใน PBS หรือ 0.05 ถึง 0.1% saponin ใน PBS สำหรับเป้าหมายที่ไวต่อเมมเบรน
- Blocking buffer: 1 ถึง 5% BSA หรือ 5 ถึง 10% normal serum ใน PBS ที่มีชนิดสัตว์โฮสต์ (host species) ตรงกับ Secondary antibody
- Wash buffer with detergent: PBS ผสม 0.05% Tween-20
- Nuclear counterstain: DAPI หรือ Hoechst 33342
- Anti-fade mountant: สูตรที่เป็นน้ำหรือกลีเซอรอล
- Aldehyde quencher (เฉพาะ PFA fixation): 50 mM ammonium chloride หรือ 0.1 M glycine ใน PBS
สำหรับการเลือกสารเคมีที่รองรับ IF รวมถึง Blocking sera, Wash buffers และสีนิวเคลียส สามารถดู รายการสินค้า Antibody และ IF reagents ที่ Chemical Express Thailand
Antibody และตัวควบคุม
คุณต้องมี Primary antibody ที่ผ่านการทดสอบแล้ว, Secondary antibody ที่ผ่านการกำจัด Cross-reaction มาอย่างดี (หรือใช้ Primary antibody ที่ Conjugate มาแล้วเพื่อความง่าย), Isotype control, No-primary control และตัวอย่างที่เป็นบวก (Positive control) อย่างน้อย 1 ชุด
สำหรับการทดลองกับเซลล์ที่มีชีวิต ให้ใช้บัฟเฟอร์ที่ปราศจาก Sodium azide และสำหรับเป้าหมายที่เมมเบรน ควรใช้สารลดแรงตึงผิวต่ำเพื่อรักษา Epitopes ไว้ระหว่างการทำ Permeabilization
การเตรียมและการ Fix ตัวอย่างสำหรับการทำ IF
การเตรียม Cell Culture
- เพาะเลี้ยงเซลล์บน Glass coverslips หรือแผ่น Plate สำหรับถ่ายภาพ 24 ถึง 48 ชั่วโมงก่อนย้อม จนกว่าเซลล์จะมีความหนาแน่น (confluence) 60 ถึง 80% ก่อน Fix
- นำอาหารเลี้ยงเชื้อออกและล้างด้วย PBS อย่างเบามือ 1 ครั้งเพื่อกำจัดโปรตีนจากซีรั่มก่อน Fix
การเตรียมชิ้นเนื้อเยื่อ (Tissue Section)
- ตัดชิ้นเนื้อแบบแช่แข็ง (cryo) หรือพาราฟินหนา 5 ถึง 10 ไมโครเมตร แล้ววางบนสไลด์ที่ประจุบวก
- สำหรับชิ้นเนื้อแบบพาราฟิน ให้ล้างไขพาราฟินออกด้วย Xylene และทำให้ชิ้นเนื้อคืนสภาพ (rehydrate) ด้วยแอลกอฮอล์ระดับต่างๆ ก่อนแช่ใน PBS
วิธี Fixation ด้วย PFA
- เตรียม 4% PFA ใหม่ใน PBS ห้ามใช้สารละลายที่เก่ากว่า 24 ชั่วโมง
- เติมสารละลาย PFA ให้ท่วมตัวอย่าง ฟักตัว 10 ถึง 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
- นำ PFA ออกอย่างระมัดระวังและล้างด้วย PBS 3 ครั้ง ครั้งละ 5 นาทีโดยเขย่าเบาๆ
- หยุดปฏิกิริยา Aldehyde ด้วยการฟักตัวใน 50 mM ammonium chloride หรือ 0.1 M glycine ใน PBS เป็นเวลา 10 นาที แล้วล้างด้วย PBS 1 ครั้ง
วิธี Fixation ด้วยเมทานอลเย็น
- แช่เมทานอล 100% ที่อุณหภูมิ -20°C
- นำ PBS ออกจากตัวอย่างแล้วเติมเมทานอลเย็นจัดทันที ฟักตัวที่ -20°C เป็นเวลา 5 ถึง 7 นาที
- นำเมทานอลออกและ Rehydrate ด้วยการล้าง PBS 3 ครั้ง ครั้งละ 5 นาที
การทำ Permeabilization
- สำหรับเป้าหมายภายในเซลล์ ให้เติม 0.1% Triton X-100 ใน PBS และฟักตัว 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง สำหรับเป้าหมายที่ไวต่อเมมเบรน ให้ใช้ 0.05 ถึง 0.1% saponin แทนเป็นเวลา 15 นาที
- ล้างด้วย PBS 3 ครั้ง ครั้งละ 5 นาที ก่อนดำเนินการต่อในขั้นตอน Blocking
การปรับ Antibody Immunofluorescence Dilution Protocol: การทำ Blocking และการไตเตรท
การทำ Blocking
- เตรียม Blocking buffer โดยใช้ 1 ถึง 5% BSA หรือ 5 ถึง 10% Normal serum ใน PBS โดยให้เลือกชนิดซีรั่มตรงกับสัตว์โฮสต์ของ Secondary antibody (เช่น ถ้า Secondary antibody สร้างจากแพะ ให้ใช้ Normal goat serum)
- เติม Blocking buffer ให้ท่วมตัวอย่าง ฟักตัว 30 ถึง 60 นาทีที่อุณหภูมิห้องโดยเขย่าเบาๆ
- ห้ามล้าง Blocking buffer ออกก่อนเติม Primary antibody ให้เทส่วนเกินออกแล้วเริ่มขั้นตอนถัดไปทันที
การไตเตรท Primary Antibody
- เตรียมการเจือจางใน Blocking buffer โดยจุดเริ่มต้นที่แนะนำคือ 1:50, 1:100, 1:250, 1:500 และ 1:1000
- ใช้ปริมาณ 100 ถึง 200 ไมโครลิตรต่อ Coverslip หรือช่องหลุม เพื่อให้ครอบคลุมพื้นที่โดยไม่รวมตัวที่ขอบ
- ฟักตัว 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยเขย่าเบาๆ หรือทิ้งไว้ข้ามคืนที่ 4°C ในตู้อบความชื้น การฟักข้ามคืนมักให้ผลลัพธ์ที่สม่ำเสมอกว่าสำหรับเป้าหมายที่มีความเข้มข้นต่ำ
- ล้างด้วย PBS ผสม 0.05% Tween-20 3 ครั้ง ครั้งละ 5 นาที หากยังมีพื้นหลังหลังย้อม Secondary antibody ให้ขยายเวลาการล้างเป็น 10 นาทีในครั้งต่อไป
- จดบันทึกเงื่อนไข antibody immunofluorescence dilution protocol ในสมุดแล็บ รวมถึงเลข Lot, วิธี Fixation, ส่วนประกอบของ Blocking buffer, เวลา และอุณหภูมิ การจดบันทึกเป็นพื้นฐานของความแม่นยำและการทำซ้ำได้ในอนาคต
ตารางด้านล่างแสดงระดับการเจือจางที่แนะนำตามชนิดตัวอย่างและความเข้มข้นของเป้าหมาย โปรดใช้เป็นจุดเริ่มต้นเท่านั้น
| ชนิด Antibody | ชนิดตัวอย่าง | การเจือจางเริ่มต้น | เวลาที่ใช้ | อุณหภูมิ |
|---|---|---|---|---|
| Primary (เป้าหมายสูง) | Cultured cells | 1:100 to 1:250 | 1 hour | Room temperature |
| Primary (เป้าหมายต่ำ) | Cultured cells | 1:50 to 1:100 | Overnight | 4°C |
| Primary (เป้าหมายสูง) | Tissue section | 1:100 to 1:500 | 1 hour or overnight | Room temperature or 4°C |
| Primary (เป้าหมายต่ำ) | Tissue section | 1:50 to 1:100 | Overnight | 4°C |
| Secondary (conjugated) | Cells or tissue | 1:200 to 1:1000 | 45 to 60 minutes | Room temperature (dark) |
การฟักตัว Secondary, การเลือก Conjugate, การล้าง และการติดสไลด์
การเลือกกลยุทธ์การตรวจวัด
กลยุทธ์การตรวจวัด: แบบไหนเหมาะกับการทดลองของคุณ?
- ความไวสูงสำหรับเป้าหมายต่ำ (การขยายสัญญาณ)
- ยืดหยุ่น: เปลี่ยน Secondary ได้โดยไม่ต้องเปลี่ยน Primary
- Protocol ยาวกว่า; เสี่ยงพื้นหลังสูงในงาน Multiplex
- ใช้ Secondary ที่ผ่านการ Cross-adsorbed สำหรับงานหลายชนิด
- Protocol สั้นลง ขั้นตอนการล้างน้อยลง
- พื้นหลังต่ำ; เหมาะสำหรับงาน mouse-on-mouse
- ไม่มีการขยายสัญญาณ; อาจพลาดเป้าหมายที่มีปริมาณน้อยมาก
- Primary แต่ละตัวต้อง Conjugate เฉพาะ; ยืดหยุ่นน้อยกว่า
- ลดพื้นหลังจาก Immunoglobulins ภายในเนื้อเยื่อ
- ย้อมลำดับถัดไปได้ด้วย Primary ชนิดเดียวกัน
- สัญญาณต่อโมเลกุลต่ำกว่า IgG ปกติ
- เหมาะสำหรับชิ้นเนื้อเมาส์และการออกแบบ Multiplex
การเลือก Fluorophores
ตรวจสอบค่าความยาวคลื่นเลเซอร์และ Filter ของกล้องจุลทรรศน์ก่อนซื้อ Alexa Fluor 488 และ Alexa Fluor 555 ให้ความสว่างและความคงทนต่อแสงดีในระบบ Confocal ส่วน FITC และ TRITC เหมาะสำหรับงาน Widefield ทั่วไป หากต้องการเป้าหมายที่ Autofluorescence สูง ให้ใช้ Far-red dyes เช่น Alexa Fluor 647 หรือ Cy5 เพราะอยู่นอกช่วงการเรืองแสงพื้นหลัง
เมื่อทำ Multiplex panel ให้กระจายสีไปตามช่อง DAPI, Green, Orange/Red และ Far-red เพื่อลด Spectral overlap
การฟักตัว Secondary Antibody
- เจือจาง Secondary antibody 1:200 ถึง 1:1000 ใน Blocking buffer ควรใช้ Secondary antibody ที่ผ่านการกำจัด Cross-reactivity อย่างเข้มงวด เมื่อทำ Multiplex เพื่อลดการจับข้ามชนิด
- ใช้ 100 ถึง 200 ไมโครลิตร ฟักตัว 45 ถึง 60 นาทีที่อุณหภูมิห้องในที่มืด
- ล้างด้วย PBS ผสม 0.05% Tween-20 3 ครั้ง ครั้งละ 5 นาทีโดยเขย่าเบาๆ และปิดบังแสงไว้เสมอ
- หากต้องการย้อมนิวเคลียส ให้ใช้ DAPI (0.1 ถึง 1 ไมโครกรัม/มล.) หรือ Hoechst 33342 เป็นเวลา 5 นาที แล้วล้างด้วย PBS อีกครั้ง
การทำ Mounting
- หยด Anti-fade mountant 20 ถึง 50 ไมโครลิตรบนสไลด์ แล้ววาง Coverslip ทำมุมเพื่อป้องกันฟองอากาศ
- ปล่อยให้เซ็ตตัว 15 ถึง 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องก่อนถ่ายภาพ สำหรับ Mountant ชนิดแข็ง ให้ทิ้งไว้ข้ามคืนก่อนเก็บที่ 4°C
- ซีลขอบ Coverslip ด้วยน้ำยาทาเล็บใสเพื่อป้องกันการแห้งและคงสภาพสไลด์
ในระบบ Confocal ให้ใช้โหมด Sequential scanning เพื่อกำจัดสัญญาณรบกวนที่เครื่องไม่สามารถแยกได้ด้วยการกรองแสงปกติ
คำแนะนำและข้อควรระวังเพื่อให้ได้ผล IF ที่สม่ำเสมอ
เคล็ดลับสำหรับการทดลอง IF ที่ทำซ้ำได้
- เขย่าแผ่นสไลด์หรือหมุนหลอดฟักตัวอย่างช้าๆ (60 ถึง 70 rpm) เพื่อให้ Antibody กระจายตัวสม่ำเสมอ
- Pre-wet หลุมหรือสไลด์ด้วย Blocking buffer ก่อนเติม Antibody เพื่อช่วยให้สารละลายกระจายตัวได้ดี
- ปรับความเข้มข้น Tween-20 (0.05 ถึง 0.1%) เพื่อหาจุดสมดุลของการล้างโดยไม่ดึง Antibody ออกจากตัวอย่าง
- จำกัดกำลังเลเซอร์และลดเวลาสแกนเพื่อป้องกัน Photobleaching
- ทดสอบ Fixation และ Permeabilization บน Positive control ก่อนเริ่มงานจริง
- ใช้ No-primary control และ Isotype control ทุกครั้งในการย้อมแต่ละ batch
- ปั่นเหวี่ยง Antibody 10,000 x g นาน 5 นาทีเพื่อกำจัดตะกอนที่ก่อให้เกิดคราบไม่พึงประสงค์
- เก็บ Antibody แยกเป็นส่วนๆ (aliquot) และเก็บตามคำแนะนำ ห้ามแช่แข็งและละลายซ้ำบ่อยครั้ง
เก็บ Antibody ที่ Conjugate แล้วที่ 4°C ในที่มืดระหว่างใช้งาน หากพบตะกอนหรือสัญญาณลดลง ให้ทิ้งทันทีเพราะเป็นสัญญาณของสารเสื่อมสภาพ
จดบันทึก Metadata การถ่ายภาพ เช่น ค่า Filter, กำลังเลเซอร์, Gain, Exposure time, กำลังขยาย และ Dilution ที่ใช้ เพื่อให้สามารถทำซ้ำได้แม่นยำ
คู่มือแก้ไขปัญหา IF
| ปัญหา | สาเหตุที่เป็นไปได้ | วิธีแก้ไข |
|---|---|---|
| พื้นหลังสูงทั่วภาพ | Blocking ไม่พอ; ความเข้มข้น Primary สูงไป; ล้างไม่สะอาด | เพิ่มเวลา Blocking; ลดความเข้มข้น Primary; เพิ่ม Tween-20; เพิ่มเวลาการล้าง |
| สัญญาณอ่อนหรือไม่ติด | เจือจาง Primary มากไป; เข้าถึงเป้าหมายยาก; Fixation ไม่เหมาะสม; Antibody เสื่อม | เพิ่มความเข้มข้น; ทดสอบ Antigen retrieval; เปลี่ยนวิธี Fixation; ตรวจสอบ Antibody กับ Positive control |
| คราบจุดๆ ไม่จำเพาะ | Antibody รวมตัวเป็นก้อน; Fc receptor จับ; Secondary จับข้ามชนิด | ปั่นเหวี่ยงก่อนใช้; เพิ่ม 10% Normal serum; เปลี่ยนเป็น Cross-adsorbed secondary |
| สัญญาณรบกวนข้ามช่อง (Bleed-through) | Fluorophore ซ้อนทับกัน; สแกนพร้อมกัน | เลือก Fluorophore ที่ต่างกัน; ใช้โหมด Sequential scanning; ตรวจสอบ Filter cube |
| Photobleaching เร็ว | กำลังเลเซอร์สูงเกิน; สีไวต่อแสง; สแกนนาน | ลดกำลังเลเซอร์; เพิ่ม Detector gain; เปลี่ยนสีที่ทนแสงขึ้น; ใช้ Anti-fade mountant |
| ขอบภาพมีปัญหา | ตัวอย่างแห้งระหว่างฟักตัว; สารละลายไม่กระจาย | ใช้ตู้อบความชื้น; เพิ่มปริมาตรสาร; Pre-wet พื้นผิว; ป้องกันอากาศเข้า |
หากสัญญาณลดลงหลังเปลี่ยนวิธี Fixation ให้เริ่มไตเตรท Antibody ใหม่อีกครั้งเพราะสภาพของ Epitope เปลี่ยนไปอย่างสิ้นเชิง
สรุป: แนวทางการทำ IF ที่ทำซ้ำได้
คุณมีกรอบการทำงานที่ครบถ้วน ตั้งแต่การ Fix และ Permeabilize ให้เหมาะสม การไตเตรท Antibody และการใช้ Sequential scanning หากคุณต้องการตรวจสอบ Antibody หรือ IF reagents คุณภาพสูง สามารถดูรายการสินค้าได้จาก Chemical Express Thailand
คำถามที่พบบ่อย
ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค
ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express
เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ Antibody Applications จาก MedChemExpress (MCE) และ Elabscience และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE
English 
Thai