fbpx

การแยกโปรตีนตามขนาดโดยใช้เทคนิค SDS-Page

เจลโพลีอะคริลาไมด์ (Polyacrylamide gels) เกิดจากการทำปฏิกิริยาระหว่าง อะคริลาไมด์และบิส-อะคริลาไมด์ซึ่งทำให้เกิดเป็นโครงสร้างเมทริกซ์  โดยโครงสร้างเจลมีการเชื่อมโยงกันเหมือนตะแกรงในระหว่างที่โปรตีนเคลื่อนผ่านสนามแม่เหล็กไฟฟ้า โดยส่วนใหญ่แล้วโปรตีนจะมีทั้งประจุบวกและลบ ซึ่งเราจะทำการแยกออกจากกันและทำให้เป็นประจุลบ ทำให้สามารถแยกโปรตีนตามขนาดได้โดยขณะที่โปรตีนวิ่งจากขั้วอิเล็กโทรดลบไปหาขั้วบวก

รูปที่ 1 SDS-PAGE ของตัวอย่างโปรตีนกับ โปรตีนมาตรฐาน color burst protein marker (C1992)

ขั้นตอนการทำ (Protocol)

อุปกรณ์และสารเคมีที่ต้องการใช้งาน

 เครื่องรันเจลแบบ Vertical electrophoresis chamber with power supply, glass plates, spacers and combs
mPAGE® Gel Casting Device Kit (MGCK-10M)

รูปที่ 2 mPAGE® Gel Casting Device Kit (MGCK-10M)

mPAGE® Mini Gel Tank แบบ 2 และ 4 เจล (MGT-2 & MGT-4)

รูปที่ 2 mPAGE® Gel Casting Device Kit (MGCK-10M)

mA700 Essential Power Supply (MA700)

รูปที่ 4 mA700 Essential Power Supply (MA700)

ReagentsComponents in the ReagentProduct Number
Acrylamide/bis-acrylamide solution 

Acrylamide 29.2 g

N,N-Methylenebis(acrylamide) 0.8 g 

A8887

M7279

 Gel casting buffers

1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (เตรียม resolving gel):
ละลาย Tris base ปริมาณ 18.15 g ในน้ำ 80 mL distilled water
ปรับ pH to 8.8
ปรับปริมาตรให้เป็น 100 mL ด้วย distilled water

0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (เตรียม stacking gel):
ละลาย Tris base ปริมาณ 6 g ในน้ำ 80 mL distilled water
ปรับ pH ให้ได้ 6.8
ปรับปริมาตรให้เป็น 100 mL ด้วย distilled water

93362
2X Laemmli loading  buffer

Bromophenol blue 0.004%

2-mercaptoethanol 10%

Glycerol 20%

SDS 4%

Tris-HCl 0.125 M

B5525

M3148

G5516

L3771

93362

10X Running buffer

Tris-HCl 25 mM

Glycine 200 mM

SDS 0.1% (w/v)

93362

G8898

L3771

10% SDS  SDSL3771
10% Ammonium persulphate  Ammonium persulphateA3678
TEMED  TEMEDT9281
หมายเหตุ : Acrylamide และ bis-acrylamide มีความเป็นพิษต่อประบบประสาท ทุกครั้งตอนในการเตรียมควรสวมใส่ถุงมือ

การเตรียมเจล (Gel Preparation)

spacer plate และ short plate และการใส่ลงไปใน Caster Frame และ Base

รูปที่ 5 spacer plate และ short plate และการใส่ลงไปใน Caster Frame และ Base

  • เตรียม spacer plate และ short plate ตามรูปโดยทั้งคู่อยู่ในชุด mPAGE® Gel Casting Device Kit (MGCK-10M)
  • ทำการเตรียม resolving gel โดยจะเตรียมปริมาตร 10 ml โดย % เจล สามารถดูได้ตามตาราง
Gel %Water (ml)30% acrylamide (ml)1.5M Tris-HCl, pH 8.8 (ml)10% SDS (ul)10% APS (ul)TAMED (ul)
8%4.62.62.610010010
10%3.83.42.610010010
12%3.242.610010010
15%2.252.610010010

***TEMED ใส่ที่หลังสุด

  • ทิ้งไว้ให้เจลแข็งตัว ประมาณ 20-30 นาที ที่อุณหภูมิห้อง
  • ทำการเตรียม stacking gel โดยจะเตรียมปริมาตร 10 ml

Gel %

Water (ml)

30% acrylamide (ml)

0.5M Tris-HCl, pH 6.8 (ml)

10% SDS (ul)

10% APS (ul)

TAMED (ul)

5%

5.86

1.34

2.6

100

100

10

***TEMED ใส่ที่หลังสุด

ตามการเติม 5% stacking gel ลงไปด้านบน แล้วทำการเสียบ comb ลงไป และทิ้งให้เจลแข็งตัวประมาณ 20-30 นาทีที่อุณหภูมิห้อ

การเตรียมตัวอย่าง (Sample Preparation)

  • นำโปรตีนตัวอย่างผสมกับ loading buffer
  • นำมาต้มที่อุณหภูมิ 95 °C นาน 5 นาที จากนั้นนำมาปั้นเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 16000xg นาน 5 นาที
  • เก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ -20 °C หรือนำไปใช้รัน gel electrophoresis ต่อไป

สารเคมีที่ต้องการใช้งาน

  • Gel Fix solution (500 ml)

               Methanol (106009) 250 ml

                Glacial acetic acid (100063) 50 ml

                Water 200 ml

  • Coomassie solution

               CBB R-250 (B6529) 0.1%

               Methanol (106009) 40%

               Glacial acetic acid (100063) 10%

  • Destain solution

               Methanol (106009) 50 ml

               Glacial acetic acid (100063) 35 ml

  • Gel storage solution

               Glacial acetic acid (100063) 25 ml

               Water 475 ml

สารเคมีที่ต้องการใช้งาน

  • หลักจากทำการรันเจลด้วยเครื่อง electrophoresis เสร็จแล้วเราจะนำเจลมาแช่ในถาดพลาสติกเพื่อทำการผสมกับ Gel fix solution โดยทำการเขย่าไปด้วย นาน 2 ชั่วโมง
  • เอาเจลที่ได้ออกจาก Gel fix solution แล้วเติม Coomassie solution เพื่อย้อมโปรตีนนาน 2- 4 ชั่วโมง
  • ทำการเติม Destain solution ลงไปในเจลเพื่อให้ล้างสีน้ำเงินของ Coomassie solution ออกแล้วเหลือแต่แถบแบนโปรตีนสีน้ำเงิน
  • หลังจากทำการล้างเสร็จแล้วสามารถสามารถเก็บเจลไว้ใน Gel storage solution หรือนำไปถ่ายรูปต่อไป
en_USEnglish