Affinity Chromatography คืออะไร? ใช้ Purify Protein ที่มี Tag อย่างไร
เมื่อคุณต้องการโปรตีนที่มีความบริสุทธิ์สูงอย่างรวดเร็ว โดยไม่มีเวลาสำหรับการทำ polishing หลายขั้นตอน Affinity chromatography คือเทคนิคที่เปลี่ยน lysate หรือ culture supernatant ที่มีความซับซ้อนให้กลายเป็นผลิตภัณฑ์ที่มีความบริสุทธิ์สูงได้ในขั้นตอนการ capture เพียงขั้นตอนเดียว บทความนี้จะอธิบายหลักการทำงาน การเลือกส่วนประกอบต่างๆ รวมถึงการตั้งค่าพารามิเตอร์ที่ควบคุมการจับ (binding), การล้าง (wash) และการชะ (elution) เพื่อให้คุณสามารถสร้างขั้นตอนการทำงานที่มีประสิทธิภาพได้ตั้งแต่เริ่มต้น
Affinity chromatography คืออะไร และใช้ทำอะไรในการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์?
Affinity chromatography เป็นเทคนิค Liquid chromatography ที่จับกับเป้าหมายเป็นโปรตีนเฉพาะเจาะจง ผ่านปฏิสัมพันธ์ที่มีความจำเพาะสูงระหว่างลิแกนด์ (ligand) ที่ยึดเกาะอยู่บนเรซิน (resin) กับส่วนประกอบที่จำเพาะบนโปรตีน ความจำเพาะ (selectivity) ของวิธีนี้สูงกว่าการใช้ ion exchange หรือ size exclusion มาก เนื่องจากเรซินถูกออกแบบมาให้จับกับโมเลกุลประเภทหนึ่งและปล่อยผ่านโมเลกุลอื่นๆ เกือบทั้งหมดไป
กรณีการใช้งานทั่วไป ได้แก่ การ capture IgG ด้วย Protein A หรือ Protein G และการทำให้โปรตีนที่มี Tag เช่น His-tag, GST, MBP หรือ Strep-tag fusion บริสุทธิ์จาก cell lysates หรือ culture supernatants กระบวนการคือการโหลดตัวอย่างภายใต้สภาวะที่เหมาะสมกับการจับ (binding conditions) กำจัดสารปนเปื้อนด้วย wash buffer และชะโปรตีนออกโดยใช้ competitive ligand, การปรับค่า pH หรือการเปลี่ยนค่าความเข้มข้นของเกลือ ในขั้นตอนการทำงานส่วนใหญ่ ขั้นตอนการ capture เพียงขั้นตอนนี้ก็เพียงพอที่จะตอบโจทย์ความบริสุทธิ์ที่ต้องการในขั้นตอนถัดไป
หลักการทำงานของ Affinity chromatography: การจับ, การล้าง และการชะ
ขั้นตอนการทำงานทีละขั้นตอน
เริ่มจากการปรับสภาวะคอลัมน์ (equilibration) ด้วยบัฟเฟอร์ที่ส่งเสริมให้เกิดปฏิสัมพันธ์เฉพาะเจาะจง เตรียม lysate หรือ supernatant ให้ใสด้วยการหมุนเหวี่ยง (centrifugation) จากนั้นกรองผ่านเมมเบรนขนาด 0.45 µm หรือ 0.22 µm ก่อนโหลด การที่สารตัวอย่างสะอาดจะช่วยยืดอายุการใช้งานของคอลัมน์และรักษาความดันย้อนกลับ (backpressure) ให้คงที่ตลอดการทดลอง
โหลดตัวอย่างด้วยอัตราการไหล (flow rate) ที่พอเหมาะ หากความจุในการจับ (binding capacity) ต่ำ ให้หยุดหรือลดอัตราการไหลเพื่อเพิ่มเวลาการสัมผัส (residence time) เก็บส่วน flowthrough ไว้เพื่อทำ mass balance หากโปรตีนเป้าหมายปรากฏในส่วนนี้ แสดงว่าเกิดการ overload หรือสภาวะการจับไม่เหมาะสม ล้างด้วยบัฟเฟอร์หลายๆ column volumes จนกว่าสัญญาณ UV baseline ที่ 280 nm จะราบเรียบ
ทำการชะ (elution) โดยใช้การแข่งขัน (competition), การปรับเปลี่ยนค่า pH หรือการเปลี่ยนความเข้มข้นของเกลือ ขึ้นอยู่กับระบบลิแกนด์ของคุณ เก็บ fraction ขนาดเล็ก 0.5 ถึง 1 mL ตรวจสอบสัญญาณ UV ที่ 280 nm ร่วมกับค่าความนำไฟฟ้า (conductivity) เพื่อระบุ fraction ที่มีพีคของโปรตีน หากคุณกำลังทำงานกับแอนติบอดีจากขั้นตอน Protein A ให้ทำค่า pH ของ eluate ที่เป็นกรดให้เป็นกลางทันทีโดยการเก็บลงใน neutralization buffer ประเมินความบริสุทธิ์ด้วย SDS-PAGE และคำนวณการฟื้นคืน (recovery) ด้วย A280 ก่อนที่จะไปยังขั้นตอน polishing ต่อไป
ทำการ regenerate และเก็บรักษาเรซินตามโปรโตคอลของผู้ผลิต การทำ Cleaning-in-place อย่างสม่ำเสมอจะช่วยรักษาความจุในการจับและคุณภาพของลิแกนด์ไว้ได้ตลอดหลายรอบการใช้งาน
ช่วงของพารามิเตอร์ตามระบบ Affinity
| Affinity System | Binding pH and Salt | Wash Condition | Elution Trigger | Key Notes |
|---|---|---|---|---|
| His-tag (Ni-NTA) | pH 7.5 to 8.0, 300 mM NaCl, 10 to 20 mM imidazole | 20 to 40 mM imidazole | 250 to 500 mM imidazole | Avoid EDTA; no strong reducing agents |
| Protein A (IgG) | Near-neutral pH, physiological salt | Binding buffer, optional high-salt wash | pH 2.7 to 3.5 (glycine) | Neutralize eluate immediately |
| GST fusion | pH 7.0 to 7.5, 140 mM NaCl | Binding buffer, several column volumes | 10 to 20 mM reduced glutathione | Keep temperature low to protect fusion |
| Strep-tag II | pH 7.0 to 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA | Binding buffer | 2.5 mM desthiobiotin | Avoid free biotin in sample; EDTA is compatible here |
ควรใช้ residence time ระหว่าง 2 ถึง 6 นาทีสำหรับเรซินประเภท soft agarose beads สำหรับเมทริกซ์ชนิดแข็ง (rigid) หรือ composite จะทนต่ออัตราการไหลที่สูงกว่าและเหมาะสำหรับระบบ LC อัตโนมัติ ในระหว่างการพัฒนาระเบียบวิธีทดสอบ ควรหลีกเลี่ยงการโหลดเกิน 70 ถึง 80 เปอร์เซ็นต์ของ dynamic binding capacity และรักษาความดันย้อนกลับให้อยู่ภายในขีดจำกัดของทั้งเรซินและอุปกรณ์ตลอดเวลา
คำแนะนำเพิ่มเติม
- กำจัดสิ่งปนเปื้อนใน lysates ด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 ถึง 15,000 x g ก่อนนำไปกรอง เพื่อลดการอุดตันจากอนุภาค
- เติมสารยับยั้งโปรตีเอส (protease inhibitor) ลงใน lysis buffer ก่อนเริ่มการทำลายเซลล์
- ใช้ 10 ถึง 40 mM imidazole ใน wash buffer สำหรับ His-tag เพื่อลดการชะปนออกมาของโปรตีนที่มี Histidine เป็นองค์ประกอบสูงจากโฮสต์
- เก็บ fraction ขนาด 0.5 ถึง 1 mL ในระหว่างการชะ เพื่อรักษาความบริสุทธิ์ของพีคให้สูงที่สุด
- ตรวจสอบการฟื้นคืน (recovery) ด้วย A280 และยืนยันตัวตนของแถบโปรตีนด้วย SDS-PAGE ก่อนเก็บรักษาหรือนำไปใช้งาน
- บันทึกความดันคอลัมน์ทุกครั้งที่ทดลอง หากความดันเริ่มต้นสูงขึ้นเรื่อยๆ แสดงว่าถึงเวลาทำความสะอาดหรือเปลี่ยนเรซินใหม่
ส่วนประกอบและวัสดุสำคัญ: ลิแกนด์, เมทริกซ์ และบัฟเฟอร์
การเลือกลิแกนด์กำหนดความจำเพาะของระบบ เลือกใช้ Protein A หรือ Protein G สำหรับ IgG, Ni-NTA หรือ cobalt สำหรับ His-tagged, glutathione resin สำหรับ GST fusion, amylose resin สำหรับ MBP fusion และลิแกนด์ประเภทเปปไทด์หรือสีสำหรับเป้าหมายเฉพาะที่ไม่มีคู่จับตามธรรมชาติ ลิแกนด์ที่คุณเลือกจะเป็นตัวกำหนดการตั้งค่าบัฟเฟอร์ในทุกขั้นตอนถัดไป
เมทริกซ์ (Support matrices) ควบคุมพฤติกรรมการไหลและความจุในการจับ Agarose beads ชนิด crosslinked เหมาะสำหรับการ capture โปรตีนขนาดใหญ่อย่างอ่อนโยนที่อัตราการไหลไม่สูงมาก ในขณะที่เมทริกซ์ชนิด rigid หรือ composite จะทนต่อความดันใช้งานที่สูงกว่า ซึ่งมีความสำคัญเมื่อคุณเปลี่ยนจากคอลัมน์ตั้งโต๊ะไปสู่ระบบ LC อัตโนมัติหรือต้องการรอบการทำงานที่เร็วขึ้น
| Ligand System | Target Class | Binding pH and Salt | Elution Trigger | Common Interferences |
|---|---|---|---|---|
| Protein A / Protein G | IgG, IgM (subclass dependent) | pH 7.0 to 7.4, physiological NaCl | pH 2.7 to 3.5 glycine | Serum IgG carryover, endotoxin |
| Ni-NTA / Co-NTA | His-tagged recombinant proteins | pH 7.5 to 8.0, 300 mM NaCl | 250 to 500 mM imidazole | EDTA, strong reductants, His-rich host proteins |
| Glutathione | GST fusion proteins | pH 7.0 to 7.5, 140 mM NaCl | Reduced glutathione 10 to 20 mM | High-temperature denaturation of GST |
| Amylose | MBP fusion proteins | pH 7.0 to 8.0, 200 mM NaCl | 10 mM maltose | Free maltose or starch in sample |
| Streptavidin / Strep-Tactin | Strep-tag fusions | pH 7.0 to 8.0, 150 mM NaCl | 2.5 mM desthiobiotin | Free biotin in media or supplements |
สำหรับการ capture IgG จาก culture supernatants หรือในกระบวนการที่ต้องการกำจัดสารพิษ (low-endotoxin), Protein A Purification Resins โดย Merck มอบขั้นตอนการ capture ครั้งแรกที่รวดเร็วและได้ความบริสุทธิ์สูงโดยไม่ต้องใช้เวลาพัฒนาวิธีนาน เรซินนี้ถูกออกแบบมาเพื่อการใช้งานซ้ำหลายครั้ง ช่วยให้การควบคุมต้นทุนต่อล็อตในงานผลิต mAb หรือวิจัยทำได้ง่ายขึ้น
องค์ประกอบของบัฟเฟอร์เป็นตัวแปรที่ 3 ที่นักวิทยาศาสตร์มักมองข้าม บัฟเฟอร์สำหรับจับ His-tag มักใช้ phosphate หรือ Tris ความเข้มข้น 20 ถึง 50 mM, 300 mM NaCl และ 10 ถึง 20 mM imidazole ส่วนบัฟเฟอร์ล้าง (wash) ในระบบเดียวกันควรใช้ imidazole 20 ถึง 40 mM เพื่อขจัดโปรตีนจากโฮสต์ที่จับได้ไม่แน่น ระบบ Protein A จะจับตัวที่ pH เป็นกลางและชะที่ pH 2.7 ถึง 3.5 ด้วยไกลซีน การทำให้เป็นกลางในขั้นตอนสุดท้ายถือเป็นสิ่งจำเป็นหากต้องการรักษากิจกรรมของแอนติบอดี
เมื่อใดควรเลือกใช้ Affinity chromatography, การประยุกต์ใช้งาน และข้อจำกัด
Affinity chromatography เป็นขั้นตอนการ capture แรกที่มีประสิทธิภาพที่สุดเมื่อมีคู่จับ (binding pair) ที่ทราบแน่ชัด ตัวอย่างทั่วไปได้แก่ IgG จาก hybridoma supernatant หรือ CHO media, เอนไซม์ที่มี His-tag จาก E. coli lysate และ GST fusion สำหรับงาน pull-down หรือศึกษาสิ่งมีชีวิต (interactome) นอกจากนี้ยังเป็นทางเลือกที่ดีก่อนการเตรียมตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์ด้วย LC-MS หรือการพัฒนา assay ซึ่งการได้โปรตีนที่สะอาดรวดเร็วนั้นสำคัญกว่าผลตอบแทนตามทฤษฎีที่สมบูรณ์แบบ
วิธีนี้มักช่วยลดความจำเป็นในการใช้คอลัมน์ capture สำหรับ ion exchange หรือ size exclusion ขั้นตอนเดียวของ Affinity สามารถลดเวลาในการประมวลผลจากหลายวันเหลือเพียงไม่กี่ชั่วโมง
ระบบ Affinity แบบไหนที่เหมาะกับเป้าหมายของคุณ?
- Monoclonal หรือ polyclonal IgG จาก cell culture หรือซีรัม
- งานที่เน้นกำจัดสารพิษ (Low-endotoxin)
- รอบการ capture ซ้ำๆ ด้วยเทคนิค cleaning-in-place
- การ capture ที่จำเพาะต่อ subclass (ตรวจสอบโปรไฟล์การจับ Fc ของแต่ละ subclass)
- โปรตีนลูกผสมที่มี 6xHis หรือ 10xHis tag
- ระบบการแสดงออกใน E. coli, ยีสต์ หรือเซลล์แมลง
- การคัดกรองโครงสร้างโปรตีนจำนวนมากพร้อมกันอย่างรวดเร็ว
- ไม่จำเป็นต้องมีส่วน Fc หรือแอนติบอดีเฉพาะเจาะจง
- โปรตีนที่แสดงออกแบบ GST fusion สำหรับงาน pull-down
- การศึกษา interactome และปฏิสัมพันธ์โปรตีน-โปรตีน
- การตัด Tag ออกตามด้วยการ capture ย้อนกลับเพื่อกำจัด GST อิสระ
- สภาวะการชะที่อ่อนโยน เหมาะกับโปรตีนที่เปราะบาง
Affinity chromatography มีข้อจำกัดที่ควรวางแผนป้องกัน การรั่วไหลของลิแกนด์จากเรซิน Protein A อาจปนออกมาใน eluate ซึ่งต้องใช้ขั้นตอน polishing สำหรับงานทางการแพทย์หรือที่ถูกควบคุม โปรตีนที่มี tag ถูกบังหรือถูกตัดทอนจะจับได้ไม่ดี ควรตรวจสอบการเข้าถึง tag ได้ในขั้นตอนการออกแบบก่อนดำเนินการ purify ขนาดใหญ่ การชะที่ pH ต่ำอาจทำให้โปรตีนที่ไวต่อกรดเสียหายได้ เป้าหมายบางอย่างอาจสูญเสียกิจกรรมแม้จะสัมผัสกับ pH ต่ำกว่า 4 ในช่วงเวลาสั้นๆ
การชะปนออกมา (co-purification) ของโปรตีนโฮสต์ที่มีโมทีฟการจับคล้ายกัน โดยเฉพาะโปรตีนที่มี His สูงบนคอลัมน์ Ni เป็นเรื่องปกติที่พบได้จาก lysates ที่ซับซ้อน การเพิ่มความเข้มข้นของ imidazole ในบัฟเฟอร์ล้างมักจะช่วยแก้ปัญหานี้ได้ แต่ความเข้มข้นที่เหมาะสมจำเป็นต้องอาศัยการทดลองจริง (empirically)
สำหรับการพัฒนาวิธีในวงกว้างข้ามเคมีของ Tag และรูปแบบการ capture, ผลิตภัณฑ์กลุ่ม Resins and LC Separation Media ของ TCI ให้คุณเข้าถึงซิลิกาเจลและสื่อพิเศษสำหรับขั้นตอน polishing หรือการทำความสะอาดตัวอย่าง เมื่อ eluate จาก Affinity ต้องการทำความสะอาดเพิ่มเติมก่อนเข้าสู่ LC-MS หรือขั้นตอน formulation, LiChroprep® Sorbent โดย Merck เป็นทางเลือกที่ปฏิบัติได้จริงสำหรับการเตรียมตัวอย่างด้วยความดันต่ำ เพื่อขจัดสิ่งปนเปื้อนตกค้างหรือเปลี่ยนบัฟเฟอร์ก่อนขั้นตอนถัดไป
สรุป
Affinity chromatography คือการ capture โปรตีนเป้าหมายผ่านการปฏิสัมพันธ์ที่ออกแบบมาหรือที่มีอยู่ตามธรรมชาติ แล้วปล่อยออกมาภายใต้สภาวะที่แม่นยำ หากทำได้อย่างถูกต้อง จะได้ความบริสุทธิ์ในระดับที่ใกล้เคียงกับขั้นตอนเดียว ซึ่งต้องใช้คอลัมน์ถึง 3 คอลัมน์หากใช้วิธีอื่น
เลือกเลือกระบบลิแกนด์ที่เหมาะสมกับประเภทโปรตีนของคุณ ปรับ pH ความเข้มข้นของเกลือ และเวลา residence time เพื่อสร้างสมดุลระหว่างความบริสุทธิ์และการฟื้นคืน (recovery) และวางแผนสำหรับการทำ pH ให้เป็นกลางหรือเปลี่ยนบัฟเฟอร์เพื่อปกป้องโปรตีนระหว่างและหลังการชะ การตัดสินใจสามประการนี้จะเป็นตัวกำหนดว่าการทดลอง purify ของคุณจะสำเร็จหรือต้องการการแก้ไขปัญหาเพิ่มเติม
คำถามที่พบบ่อย
ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค
ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express
เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ ห้องปฏิบัติการ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE
English 
Thai