Liquid Chromatography (LC) คืออะไร? ต่างจาก HPLC อย่างไร
คุณจำเป็นต้องตัดสินใจว่าระบบ LC แบบทั่วไปเพียงพอสำหรับงานวิเคราะห์ของคุณหรือไม่ หรือจำเป็นต้องใช้ประสิทธิภาพของ HPLC เพื่อให้ได้เป้าหมายด้านความละเอียด (Resolution) ความเร็ว และความไว (Sensitivity) ที่ต้องการ ทั้งงบประมาณ เกรดของตัวทำละลาย อายุการใช้งานของคอลัมน์ และความเข้ากันได้ของตัวตรวจวัด (Detector) ล้วนเป็นปัจจัยในการตัดสินใจ คู่มือฉบับนี้จะเปรียบเทียบ Liquid Chromatography และ HPLC แบบเคียงข้างกัน อธิบายหลักการทำงานของ LC ในระดับปฏิบัติการ และให้คำแนะนำในการเลือกใช้ผลิตภัณฑ์ที่เหมาะสมกับกระบวนการทำงานในห้องปฏิบัติการในประเทศไทย
LC vs HPLC: มีความแตกต่างกันอย่างไร?
Liquid Chromatography เป็นเทคนิคการวิเคราะห์ในภาพรวมที่ใช้เฟสเคลื่อนที่ (Mobile phase) ที่เป็นของเหลวพาสารวิเคราะห์ผ่านเฟสอยู่กับที่ (Stationary phase) โดยอาศัยความแตกต่างของการจับกัน (Differential interaction) ในการแยกสาร ส่วน HPLC คือรูปแบบหนึ่งของ Liquid Chromatography ประสิทธิภาพสูงที่ใช้เฟสอยู่กับที่ที่มีขนาดอนุภาคเล็กกว่า มีแรงดันในการใช้งานสูงกว่า และมีการควบคุมระบบที่แม่นยำกว่า เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการแยก ความละเอียด และความเร็ว ทั้งสองเทคนิคใช้หลักการฟิสิกส์พื้นฐานเดียวกัน ความแตกต่างอยู่ที่ขีดความสามารถของฮาร์ดแวร์และผลลัพธ์ของประสิทธิภาพ
ความแตกต่างทั่วไปมักขึ้นอยู่กับขนาดอนุภาค แรงดันในการทำงาน ความเร็วในการรัน และความเหมาะสมสำหรับงานระดับร่องรอย (Trace-level) โดย LC แบบทั่วไปจะใช้อนุภาคขนาดใหญ่กว่าที่แรงดันต่ำกว่า ซึ่งเพียงพอสำหรับการแยกสารที่ไม่ซับซ้อน ส่วน HPLC ต้องการปั๊ม หัวฉีด และคอลัมน์ที่มีประสิทธิภาพสูงกว่า แต่ให้พีคที่คมชัดกว่า รอบการทำงานที่เร็วกว่า และขีดจำกัดการตรวจวัดที่ต่ำกว่าสำหรับตัวอย่างที่ยากต่อการวิเคราะห์
| ระบบ | แรงดันปกติ | ขนาดอนุภาค | อัตราการไหล | เวลาในการรัน | การใช้งานทั่วไป |
|---|---|---|---|---|---|
| Conventional LC | <100 bar | 10–50 µm | 0.5–5 mL/min | นาน (30–60+ min) | ห้องปฏิบัติการการสอน, การแยกสารระดับเตรียมตัวอย่าง, การตรวจสอบความบริสุทธิ์แบบง่าย |
| HPLC | Up to ~400 bar | 3–5 µm | 0.5–2 mL/min | ปานกลาง (5–30 min) | QC ประจำวัน, การศึกษาความคงตัว, การทำโปรไฟล์สิ่งเจือปน |
| UHPLC | >600 bar | 1.7–2.7 µm (sub-2 µm or superficially porous) | 0.1–0.8 mL/min (narrow bore) | สั้น (1–10 min) | QC ที่ต้องการประสิทธิภาพสูง, LC-MS, การวิเคราะห์ทางชีวภาพ |
Liquid Chromatography ทำงานอย่างไร: หลักการและการคงอยู่ของสาร (Retention)
Liquid Chromatography แยกองค์ประกอบของตัวอย่างโดยอาศัยการแบ่งส่วนที่แตกต่างกันระหว่างเฟสอยู่กับที่ที่บรรจุอยู่ในคอลัมน์และเฟสเคลื่อนที่ที่เป็นของเหลวที่กำลังไหล การคงอยู่ของสาร (Retention) ขึ้นอยู่กับสภาพขั้ว (Polarity) ของสารวิเคราะห์แต่ละชนิด, คุณสมบัติการไม่ชอบน้ำ (Hydrophobicity), ระดับการแตกตัวเป็นไอออน และปฏิสัมพันธ์เฉพาะตัวกับ Ligand ที่ยึดเกาะและสาร Silanols ที่หลงเหลืออยู่บนพื้นผิว องค์ประกอบที่ทำปฏิกิริยากับเฟสอยู่กับที่ได้รุนแรงกว่าจะถูกชะออกมาในภายหลัง
การรันแบบ Isocratic จะรักษาองค์ประกอบของตัวทำละลายให้คงที่ตลอดการแยก ส่วนการรันแบบ Gradient จะเพิ่มความสามารถในการชะ (Elution strength) ขึ้นเรื่อยๆ ซึ่งมีประโยชน์ในการแยกตัวอย่างที่ซับซ้อนซึ่งมีทั้งสารที่มีขั้วสูงที่ถูกชะออกมาก่อนและสารที่ชอบน้ำที่ถูกกักเก็บไว้นาน โหมด Gradient ยังช่วยลดเวลาในการรันเมื่อเทียบกับวิธี Isocratic ที่ต้องรองรับช่วงขั้วของสารที่กว้าง
ประสิทธิภาพของระบบแปรผันตามขนาดอนุภาค อัตราการไหล อุณหภูมิคอลัมน์ และการกระจายตัวนอกคอลัมน์ (Extra-column dispersion) อนุภาคขนาดเล็กลงในอัตราการไหลที่เหมาะสมจะสร้าง Theoretical plates ต่อหน่วยความยาวได้มากกว่า นี่คือเหตุผลที่คอลัมน์ HPLC และ UHPLC ให้ประสิทธิภาพเหนือกว่าคอลัมน์ LC ทั่วไปอย่างสม่ำเสมอ ทั้งในด้านความละเอียดและความจุของพีค (Peak capacity) แม้จะใช้ความยาวคอลัมน์ที่สั้นกว่าก็ตาม
เคล็ดลับด่วน: การปรับแต่งการคงอยู่ของสารโดยไม่ต้องเปลี่ยนคอลัมน์
- ปรับสัดส่วนตัวทำละลายอินทรีย์เพิ่มขึ้นทีละ 5% เพื่อปรับเปลี่ยนการเลือกแยก (Selectivity) โดยไม่ต้องรอนานในการปรับสมดุลใหม่
- ปรับค่า pH ของเฟสเคลื่อนที่ (ภายในช่วงที่คอลัมน์รองรับได้) เพื่อควบคุมการแตกตัวเป็นไอออนของสารวิเคราะห์ที่เป็นกรดหรือด่าง
- เปลี่ยนชนิดของ Buffer หรือเติม Formic acid หรือ Ammonium formate เพื่อให้พีคของสารที่เป็นเบสคมชัดขึ้น
- เพิ่มอุณหภูมิคอลัมน์ขึ้น 5–10 °C เพื่อลดความหนืด ลดแรงดันย้อนกลับ (Backpressure) และเร่งการชะ
- ใช้ช่วง Gradient แบบค่อยเป็นค่อยไปสำหรับกลุ่มพีคที่หนาแน่น แทนการเพิ่มความชันของ Gradient ทั้งหมด
- ควบคุมให้อัตราการไหลไม่เกินขีดจำกัดสูงสุดของคอลัมน์เพื่อป้องกันขีดจำกัดแรงดันและความเสียหายของชั้นอนุภาค
ส่วนประกอบหลักและพารามิเตอร์ของวิธีสำหรับ LC และ HPLC
ทุกระบบ LC หรือ HPLC ประกอบด้วย 5 ส่วนประกอบหลัก ได้แก่ ปั๊ม หัวฉีด คอลัมน์ ตัวตรวจวัด และระบบจัดการข้อมูล ส่วนประกอบเหล่านี้ต้องมีความเข้ากันได้ในแง่ของระดับแรงดัน ปริมาตรภายใน (เพื่อลดการกระจายตัวของพีค) และความไวของตัวตรวจวัด ความไม่เข้ากัน ณ จุดใดจุดหนึ่ง เช่น การใช้คอลัมน์อนุภาคเล็กที่มีประสิทธิภาพสูงบนปั๊มที่มีความแม่นยำในการไหลต่ำ จะลดคุณภาพการแยกโดยตรง
| พารามิเตอร์ | Conventional LC | HPLC | ผลต่อการแยก |
|---|---|---|---|
| ขนาดอนุภาค | 10–50 µm | 3–5 µm (or 2.7 µm superficially porous) | อนุภาคเล็กลงช่วยเพิ่ม Plate count และความละเอียด |
| แรงดันใช้งาน | <100 bar | Up to ~400 bar | แรงดันสูงช่วยให้การไหลเร็วขึ้นโดยไม่สูญเสียประสิทธิภาพ |
| อัตราการไหล | 0.5–5 mL/min | 0.5–2 mL/min (column ID dependent) | การไหลส่งผลต่อความเร็วและความกว้างของพีค |
| ความยาวคอลัมน์ | 25–50 cm (typical) | 5–25 cm | คอลัมน์ที่สั้นกว่าพร้อมอนุภาคที่เล็กกว่าให้ผลลัพธ์เทียบเท่ากันได้เร็วกว่า |
| การควบคุมอุณหภูมิ | Ambient or limited | Thermostatted (typically ±0.1 °C) | ความเสถียรของอุณหภูมิส่งผลโดยตรงต่อความแม่นยำของ Retention time |
| ปริมาตรการฉีด | 10–100 µL | 1–50 µL (method dependent) | การฉีดมากเกินไปทำให้พีคกว้างขึ้นในคอลัมน์อนุภาคเล็ก |
คอลัมน์และเฟสอยู่กับที่
เฟสอยู่กับที่ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดใน LC และ HPLC คือ Reversed-phase C18 (octadecyl silica) ซึ่งสามารถกักเก็บสารวิเคราะห์ที่ไม่ชอบน้ำจากเฟสเคลื่อนที่เป็นน้ำได้ ส่วน C8 และ Phenyl ให้ความสามารถในการเลือกแยกที่แตกต่างกันสำหรับสารที่มีโครงสร้างคล้ายคลึงกัน สำหรับสารที่มีขั้วที่ไม่ถูกกักเก็บบน C18 เฟส HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography) จะแยกโดยอาศัยกลไกการแบ่งส่วนที่แตกต่างกันโดยใช้ชั้นของน้ำบนพื้นผิวของเฟสอยู่กับที่ ส่วนเฟส Ion-exchange จะใช้จัดการกับสารที่มีประจุในตัวอย่างทางชีวภาพและสิ่งแวดล้อม
ขนาดรูพรุน (Pore size) มีความสำคัญเมื่อทำงานกับโมเลกุลขนาดใหญ่: รูพรุนขนาด 90–120 Å เหมาะกับโมเลกุลขนาดเล็ก ในขณะที่สารชีวโมเลกุลมักต้องการ 300 Å หรือใหญ่กว่าเพื่อหลีกเลี่ยงการแพร่ที่ถูกจำกัด อนุภาคแบบ Superficially porous (Fused-Core®) ให้ Plate count ที่สูงที่แรงดันย้อนกลับต่ำกว่าอนุภาคแบบ Porous เต็มรูปแบบที่มีขนาดเท่ากัน ซึ่งเป็นประโยชน์ในระบบ HPLC มาตรฐานที่ไม่สามารถรองรับแรงดันระดับ UHPLC ได้
คอลัมน์ Ascentis® Express C18 ใช้เทคโนโลยีอนุภาค Fused-Core® และสามารถแยกตัวอย่างที่ซับซ้อนในกระบวนการ Reversed-phase ทั่วไป รวมถึงการควบคุมคุณภาพในอุตสาหกรรมยาและอาหาร โดยไม่จำเป็นต้องใช้ปั๊มระดับ UHPLC รุ่น Ascentis® Express 120 Å C18 pH+ ช่วยขยายช่วง pH ที่ใช้งานได้ ปกป้องอายุการใช้งานของคอลัมน์เมื่อใช้เฟสเคลื่อนที่ที่เป็นเบสหรือกรดสำหรับการวิเคราะห์สารที่ท้าทาย
เฟสเคลื่อนที่และตัวทำละลาย
วิธี Reversed-phase มักใช้ Buffer ที่เป็นน้ำหรือน้ำผสมกับ Acetonitrile หรือ Methanol เป็นตัวปรับสภาพความเป็นอินทรีย์ Acetonitrile ให้ความหนืดที่ต่ำกว่าและมีประสิทธิภาพในการชะสูงกว่าเล็กน้อยเมื่อเทียบกับ Methanol ในเปอร์เซ็นต์ที่เท่ากัน สารเติมแต่ง เช่น Formic acid, Ammonium formate หรือ Ammonium acetate จะถูกเลือกใช้เพื่อควบคุมการแตกตัวเป็นไอออนของสารวิเคราะห์และความเข้ากันได้กับตัวตรวจวัด
สำหรับวิธี LC-MS ความบริสุทธิ์ของตัวทำละลายไม่ใช่ทางเลือกแต่เป็นข้อกำหนด สารปนเปื้อนในเฟสเคลื่อนที่จะทำให้เกิดไอออนรบกวน (Background ions) ลดทอนสัญญาณที่ต้องการ และทำให้เกิดการเลื่อนของค่า Retention time ตัวทำละลาย LiChrosolv® Solvents จาก Merck ครอบคลุมเกรด LC และ UHPLC รวมถึงตัวเลือกที่ผ่านการรับรองสำหรับ LC-MS ซึ่งช่วยลดสัญญาณรบกวนพื้นหลังและปรับปรุงความแม่นยำในแต่ละวัน ซึ่งส่งผลโดยตรงต่อความน่าเชื่อถือของการวิเคราะห์เชิงปริมาณในงานที่ถูกควบคุม
ตัวตรวจวัดและแรงดันของระบบ
ตัวตรวจวัด UV และ Diode Array Detectors (DAD) ครอบคลุมการใช้งานทั่วไปส่วนใหญ่ ส่วน Fluorescence detection เพิ่มความไวสำหรับสารเรืองแสงตามธรรมชาติหรือสารที่ทำปฏิกิริยาก่อนตรวจวัด Mass spectrometry ให้ความสามารถในการเลือกแยกที่จำเป็นในตัวอย่างที่ซับซ้อน เช่น สารคัดหลั่งทางชีวภาพ สารสกัดจากสิ่งแวดล้อม หรือการคัดกรองยาฆ่าแมลงหลายชนิด ซึ่ง UV ไม่สามารถแยกแยะสารที่ถูกชะออกมาพร้อมกันได้
คอลัมน์อนุภาคเล็กที่มีประสิทธิภาพสูงสร้างแรงดันย้อนกลับมากขึ้น โดยเฉพาะเมื่อใช้อัตราการไหลสูงหรือใช้เฟสเคลื่อนที่ที่มีความหนืดสูง ซีลของปั๊ม ประสิทธิภาพของ Degasser และอุปกรณ์เชื่อมต่อต้องได้รับการดูแลเพื่อจัดการกับแรงดันที่เกิดขึ้นโดยไม่ทำให้พีคบิดเบี้ยวหรือค่า Retention time เลื่อน
การประยุกต์ใช้งานและการเลือก LC หรือ HPLC ในห้องปฏิบัติการไทย
Conventional LC เหมาะสำหรับสภาพแวดล้อมการเรียนการสอน การตรวจสอบความบริสุทธิ์แบบง่าย และการแยกสารในระดับเตรียมตัวอย่าง ซึ่งอนุภาคขนาดใหญ่และแรงดันต่ำเป็นข้อได้เปรียบในทางปฏิบัติ ส่วน HPLC เป็นทางเลือกที่ถูกต้องสำหรับการ QC ประจำวัน วิธีวิเคราะห์ความคงตัว การทำโปรไฟล์สิ่งเจือปน การคัดกรองยาฆ่าแมลง สารพิษจากเชื้อรา และงานวิเคราะห์ทางชีวภาพใดๆ ที่ความละเอียดและขีดจำกัดการตรวจวัดที่ต่ำเป็นข้อกำหนดของวิธี ไม่ใช่เพียงแค่ความต้องการ
ความซับซ้อนของตัวอย่างเป็นตัวกำหนดการเลือกคอลัมน์และตัวทำละลายมากกว่าตัวชื่อเทคนิค สำหรับสารสกัดสมุนไพรและตัวอย่างอาหารที่ซับซ้อน การชะแบบ Gradient บนเฟส C18 หรือ HILIC สามารถแยกสารที่มีขั้วและไม่มีขั้วที่ออกมาพร้อมกันได้ ซึ่งจะเป็นปัญหาภายใต้สภาวะ Isocratic สำหรับสารตกค้างในระดับ ppb การใช้ HPLC หรือ UHPLC คู่กับตัวทำละลายเกรด MS และระบบท่อที่มีการกระจายตัวต่ำจะช่วยรักษาอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนและลดขีดจำกัดการวัดเชิงปริมาณได้
เมื่อเมทาโบไลต์ที่มีขั้ว น้ำตาล หรือสารที่ชอบน้ำไม่ถูกกักเก็บบนคอลัมน์ Reversed-phase, HILIC คือวิธีแก้ไขที่ปฏิบัติได้จริง คอลัมน์ Ascentis® Express 160Å ZIC®-cHILIC กักเก็บสารเหล่านี้ผ่านกลไกที่แตกต่าง ทำให้เป็นตัวช่วยที่ลงตัวกับ C18 ในงานด้านเมแทบอโลมิกส์และคาร์โบไฮเดรต กลุ่มผลิตภัณฑ์ HPLC/UHPLC Solvents and Reagents ของ TCI รวมถึง Acetonitrile, Methanol, Isopropyl alcohol และสารเติมแต่งเกรดสารเคมี ช่วยสนับสนุนองค์ประกอบ Gradient ที่สม่ำเสมอและเส้น Baseline ที่สะอาดในตัวตรวจวัด UV และ MS
คู่มือตัดสินใจด่วน: เทคนิคไหนเหมาะกับงานของคุณ?
- ห้องปฏิบัติการการสอนและฝึกอบรม
- การแยกสารเป้าหมายในระดับเตรียมตัวอย่าง
- การตรวจสอบความบริสุทธิ์แบบง่ายที่มีช่วงพีคกว้าง
- ระบบแรงดันต่ำที่มีใช้งานอยู่แล้ว
- งานที่เน้นต้นทุนโดยมีข้อกำหนด LOQ ไม่สูงนัก
- การ QC ประจำวันและวิธีตามเภสัชตำรับ
- การศึกษาความคงตัวและทำโปรไฟล์สิ่งเจือปน
- การคัดกรองยาฆ่าแมลง สารพิษจากเชื้อรา และยาสัตว์
- การวิเคราะห์หาคุณลักษณะของอาหารและสมุนไพร
- การวิเคราะห์ทางชีวภาพที่ต้องการการควบคุม Retention ที่แน่นอน
- การ QC ที่ต้องการประสิทธิภาพสูงและรอบเวลาสั้น
- งาน LC-MS และ LC-MS/MS โดยใช้คอลัมน์ขนาดรูแคบ
- วิธีวิเคราะห์ที่ใช้อนุภาค sub-2 µm เพื่อความละเอียดสูงสุด
- งานเมแทบอโลมิกส์และการทำโปรไฟล์สารหลายองค์ประกอบ
- วิธีการที่โอนย้ายมาจาก HPLC เพื่อเพิ่มความเร็ว
สรุป: LC vs HPLC ในมุมมองเดียว
Liquid chromatography เป็นเทคนิคแม่บท ส่วน HPLC คือการนำมาประยุกต์ใช้อย่างมีประสิทธิภาพสูง โดยขยายขอบเขตการทำงานผ่านอนุภาคที่เล็กลง การทนต่อแรงดันที่สูงขึ้น และการควบคุมระบบที่แม่นยำขึ้น ผลลัพธ์ที่ได้คือการแยกสารที่เร็วกว่า พีคที่คมชัดกว่า และขีดจำกัดการตรวจวัดที่ต่ำกว่าบนหลักการทางเคมีเดียวกัน
ควรเลือกใช้ตามข้อกำหนดด้านความละเอียด ความซับซ้อนของตัวอย่าง เป้าหมาย LOD หรือ LOQ และขีดความสามารถของระบบที่มีอยู่จริง จับคู่ขนาดอนุภาคคอลัมน์และคุณสมบัติเคมีให้เข้ากับตัวตรวจวัดและขีดจำกัดแรงดันของคุณ เลือกเกรดตัวทำละลายให้เหมาะสมกับตัวตรวจวัด: งาน LC-MS ต้องการตัวทำละลายที่มีความบริสุทธิ์สูง; งาน QC ประจำวันแบบ UV สามารถใช้สารเคมีเกรด HPLC มาตรฐานได้โดยไม่สูญเสียคุณภาพ การจับคู่ที่ถูกต้องช่วยรักษาทรงของพีค ปกป้องคอลัมน์ และทำให้เวลาที่ใช้งานได้จริง (Uptime) คาดการณ์ได้
คำถามที่พบบ่อย
ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค
ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express
เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ ห้องปฏิบัติการ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE
English 
Thai