General Knowledge Protein Biology & Biochemistry Amino Acid Fundamentals

กรดอะมิโนจำเป็นคืออะไร? 9 ชนิดที่ร่างกายสร้างเองไม่ได้และบทบาทในงานวิจัย

ทีมวิเคราะห์ที่ทำการวัดปริมาณกรดอะมิโนอิสระในพลาสมา อาหารเลี้ยงเชื้อเซลล์ หรือเมทริกซ์อาหาร มักต้องตัดสินใจเลือกวิธีวิเคราะห์ตั้งแต่ก่อนเริ่มเตรียมตัวอย่าง การตัดสินใจที่ผิดพลาดจะทำให้สิ้นเปลืองน้ำยา ล่าช้าในการทำ validation และได้ข้อมูลที่อาจถูกตั้งคำถามจากผู้ทบทวน บทความนี้ได้นิยามกรดอะมิโนจำเป็น (essential amino acids) ทั้ง 9 ชนิด อธิบายความสำคัญในงานวิจัย และสรุปกลยุทธ์ด้านโครมาโทกราฟีเพื่อให้คุณสามารถเลือกแนวทางและสารมาตรฐานที่ถูกต้องได้ตั้งแต่ต้น

กรดอะมิโนจำเป็นคืออะไร

กรดอะมิโนจำเป็นคือกรดอะมิโน 9 ชนิดที่ร่างกายมนุษย์ไม่สามารถสังเคราะห์ขึ้นได้ในปริมาณที่เพียงพอต่อความต้องการทางสรีรวิทยา จึงจำเป็นต้องได้รับผ่านทางอาหาร อาหารเลี้ยงเชื้อ หรือการเสริมในงานทดลอง ในทางวิจัย กรดอะมิโนเหล่านี้มักถูกใช้เป็นตัวแปรควบคุมในการศึกษาด้านโภชนาการ เมแทบอลิซึม และกลไกต่าง ๆ

ทั้ง 9 ชนิด ได้แก่: ฮิสทิดีน (histidine), ไอโซลิวซีน (isoleucine), ลิวซีน (leucine), ไลซีน (lysine), เมทไทโอนีน (methionine), ฟีนิลอะลานีน (phenylalanine), ทรีโอนีน (threonine), ทริปโตเฟน (tryptophan) และวาลีน (valine) แต่ละชนิดมีทิศทางทางเมแทบอลิซึมที่แตกต่างกัน ซึ่งส่งผลโดยตรงต่อการกำหนดความเข้มข้นที่เติมลงไป (spike-in) วิธีการตรวจวัด และการออกแบบการทดลอง

ข้อควรระวังเพิ่มเติม: อาร์จินีน (arginine) เป็นกรดอะมิโนที่จำเป็นในบางสภาวะทางสรีรวิทยา เช่น ในผู้ป่วยวิกฤตหรือช่วงที่มีการเติบโตอย่างรวดเร็ว อย่างไรก็ตาม อาร์จินีนไม่ได้จัดอยู่ในรายการกรดอะมิโนจำเป็น 9 ชนิดมาตรฐาน ดังนั้นในการออกแบบงานวิจัยด้านโภชนาการทางคลินิกหรือการดูแลผู้ป่วยหนัก ควรระบุสถานะของอาร์จินีนแยกต่างหาก

ผลกระทบเชิงปฏิบัติครอบคลุมหลายสาขาวิชา ทีมเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อต้องการความเข้มข้นของสารมาตรฐานที่แม่นยำเพื่อป้องกันการอิ่มตัวของตัวขนส่ง (transporter) ห้องปฏิบัติการควบคุมคุณภาพอาหารและผลิตภัณฑ์เสริมอาหารต้องการวัสดุอ้างอิงรับรอง (certified reference materials) เพื่อยืนยันการกล่าวอ้างบนฉลาก ส่วนการศึกษา Isotope tracing ต้องการรูปแบบที่มีการติดฉลากไอโซโทปที่มีความบริสุทธิ์สูงเพื่อติดตามการไหลเวียนผ่านวิถีเฉพาะโดยไม่มีการปนเปื้อนจากกรดอะมิโนที่ไม่ได้ติดฉลาก

ความสำคัญของกรดอะมิโนจำเป็นต่อเมแทบอลิซึม อาหาร และแบบจำลองเซลล์

กรดอะมิโนจำเป็นทั้ง 9 ชนิดมีความสัมพันธ์โดยตรงกับแหล่งอาหาร การหมุนเวียนของโปรตีน และสมดุลไนโตรเจน เมื่อระดับของกรดอะมิโนชนิดใดชนิดหนึ่งลดลงต่ำกว่าเกณฑ์ในอาหารเลี้ยงเชื้อหรือในสิ่งมีชีวิต ผลลัพธ์ที่วัดได้อาจเปลี่ยนแปลงจนถูกตีความผิดว่าเป็นผลจากการทดลอง ทั้งที่จริงแล้วเกิดจากข้อจำกัดของแหล่งสารอาหาร

กรดอะมิโนสายโซ่กิ่งและสัญญาณ mTOR

ลิวซีน, ไอโซลิวซีน และวาลีน รวมกันเป็นกรดอะมิโนสายโซ่กิ่ง (Branched-chain amino acids หรือ BCAAs) โดยเฉพาะลิวซีนที่กระตุ้น mTOR complex 1 ทำให้ความเข้มข้นของ BCAAs เป็นตัวแปรที่มีความไวสูงในการศึกษาการสังเคราะห์โปรตีนและการส่งสัญญาณอะนาโบลิก การเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยของลิวซีนส่งผลให้ค่าการฟอสโฟรีเลชันเปลี่ยนแปลงอย่างเห็นได้ชัด ดังนั้นควรตรวจสอบความเข้มข้นของอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยวิธีวิเคราะห์มากกว่าการยึดตามสูตรการเตรียมเพียงอย่างเดียว

เมแทบอลิซึมแบบหนึ่งคาร์บอนและสารตั้งต้นของแคทีโคลามีน

เมทไทโอนีนมีบทบาทในวัฏจักรเมทิล (methyl cycle) โดยทำหน้าที่เป็นผู้ให้หมู่เมทิลผ่าน S-adenosylmethionine (SAM) การศึกษาวิจัยเกี่ยวกับการจำกัดเมทไทโอนีน (methionine restriction) จะจงใจลดแหล่งสารนี้เพื่อตรวจสอบการควบคุมอีพิเจเนติกส์และวิถีการมีอายุยืนยาว ฟีนิลอะลานีนเป็นสารตั้งต้นโดยตรงของไทโรซีนและส่งผลต่อเนื่องไปยังแคทีโคลามีน (catecholamine) เช่น โดพามีนและนอร์เอพิเนฟริน ดังนั้นการวิเคราะห์ไทโรซีนหรือแคทีโคลามีนต้องคำนึงถึงระดับฟีนิลอะลานีนด้วย

ทริปโตเฟนและฮิสทิดีนในด้านภูมิคุ้มกันวิทยาและการบัฟเฟอร์

ทริปโตเฟนแตกแขนงออกเป็น 2 วิถีแข่งขันกัน ได้แก่ วิถีเซโรโทนินผ่าน 5-hydroxytryptophan และวิถีไคนูเรนีน (kynurenine) ซึ่งสนับสนุนการสังเคราะห์ NAD+ และปรับสมดุลความทนทานของภูมิคุ้มกัน การวัดทริปโตเฟนพร้อมกับเมแทบอไลต์ปลายทางจึงต้องใช้วิธีการแบบกลุ่ม (panel approach) ฮิสทิดีนช่วยบัฟเฟอร์ pH ภายในเซลล์ผ่านหมู่ข้างเคียงอิมิดาโซลและเป็นสารตั้งต้นของฮิสตามีน ซึ่งมีความเกี่ยวข้องทั้งในสรีรวิทยาการออกกำลังกายและแบบจำลองการอักเสบ

การประยุกต์ใช้ชีวเคมีสู่เวิร์กโฟลว์การเพาะเลี้ยงเซลล์

การอิ่มตัวของตัวขนส่งเป็นประเด็นที่มักถูกมองข้ามในการออกแบบอาหารเลี้ยงเชื้อ เช่น การเติมลิวซีนมากเกินไปอาจทำให้เกิดการแข่งขันในการดูดซึมกรดอะมิโนชนิดอื่นที่ใช้ตัวขนส่ง LAT1 ร่วมกัน ควรเฝ้าติดตามจินทิกส์การดูดซึมและจัดเวลาการเสริมกรดอะมิโนให้สอดคล้องกับช่วงเวลาการสุ่มเก็บตัวอย่าง เพื่อป้องกันการตีความการแข่งขันของตัวขนส่งว่าเป็นผลลัพธ์ของฟีโนไทป์

ข้อแตกต่างที่สำคัญ: กรดอะมิโนที่จำเป็นในบางสภาวะ (conditionally required) ควรได้รับการบันทึกแยกจากกรดอะมิโนจำเป็น 9 ชนิดมาตรฐานในทุกขั้นตอนของวิธีวิเคราะห์ นอกจากนี้ต้องแยกแยะให้ชัดเจนระหว่างกลุ่มกรดอะมิโนอิสระและเศษส่วนไฮโดรไลเซตที่จับกับโปรตีน การนำมารวมกันเป็นสาเหตุที่พบบ่อยของผลการทดลองที่ไม่สามารถทำซ้ำได้ระหว่างห้องปฏิบัติการ

เมื่อเริ่มทำการทดลอง Isotope tracing ด้วยกรดอะมิโนจำเป็นที่ติดฉลาก การเริ่มต้นด้วยวัสดุอ้างอิงรับรองที่มีความบริสุทธิ์ของไอโซโทปที่ทราบค่าจะช่วยป้องกันการคำนวณการเพิ่มขึ้นที่คลาดเคลื่อน สารมาตรฐาน Amino Acids จาก Merck มอบเอกสารการสอบกลับได้ที่จำเป็นสำหรับการตีพิมพ์ในวารสารวิชาการและการยื่นขออนุมัติทางกฎระเบียบ

จดหมายข่าว CHEMEX

รับข่าวสารที่เกี่ยวข้องกับบทความนี้

รับบทความวิทยาศาสตร์ คู่มือปฏิบัติในห้องปฏิบัติการ และข้อมูลเชิงลึกด้านงานวิจัยที่คัดสรรตามความสนใจของคุณ รับรองว่าไม่มีสแปม — ไม่เกินสัปดาห์ละ 1 ฉบับ!

กรุณายอมรับประกาศความเป็นส่วนตัว

ยกเลิกรับข่าวสารได้ทุกเมื่อ

9 ชนิดของกรดอะมิโนจำเป็นและบทบาทในงานวิจัย

กรดอะมิโนจำเป็นแต่ละชนิดนำเสนอความท้าทายในการวิเคราะห์และบริบททางชีวภาพที่เฉพาะเจาะจง ตารางด้านล่างสรุปพารามิเตอร์ทางเคมีและงานวิจัยที่สำคัญเพื่อเป็นแนวทางในการออกแบบการทดลอง การเลือกความเข้มข้น และข้อกำหนดความไวของวิธีวิเคราะห์

ชื่อรหัส 3 ตัวอักษรรหัส 1 ตัวอักษรค่า pKa / pI หลักความเป็นขั้วบทบาททางชีวภาพหลักเมทริกซ์ตัวอย่างทั่วไปวิธีวิเคราะห์ที่แนะนำ
HistidineHisHpI 7.59มีประจุบวก (basic)บัฟเฟอร์ pH, สารตั้งต้นฮิสตามีน, การประสานกับโลหะพลาสมา, ปัสสาวะ, อาหารเลี้ยงเชื้อHILIC-MS/MS หรือ OPA/FMOC-HPLC-FLD
IsoleucineIleIpI 6.02ไม่มีขั้ว / ไม่ชอบน้ำBCAA; สังเคราะห์โปรตีน, สารตั้งต้นน้ำตาลพลาสมา, DBS, อาหารเลี้ยงเชื้อLC-MS/MS (MRM); AQC derivatization สำหรับ HPLC-FLD
LeucineLeuLpI 5.98ไม่มีขั้ว / ไม่ชอบน้ำBCAA; กระตุ้น mTOR, เสริมสร้างโปรตีนพลาสมา, ชิ้นเนื้อกล้ามเนื้อ, อาหารเลี้ยงเชื้อLC-MS/MS (MRM); isotope tracing ด้วย [U-13C6]
LysineLysKpI 9.74มีประจุบวก (basic)เชื่อมข้ามคอลลาเจน, สารตั้งต้น acetyl/methylated histoneพลาสมา, ปัสสาวะ, อาหารไฮโดรไลเซตCation-exchange chromatography หรือ LC-MS/MS
MethionineMetMpI 5.74ไม่มีขั้ว / มีกำมะถันให้หมู่เมทิลผ่าน SAM, ตัวบ่งชี้ภาวะ oxidative stressพลาสมา, อาหารเลี้ยงเชื้อ, ปัสสาวะLC-MS/MS; ลดการออกซิเดชันด้วยสารต้านอนุมูลอิสระ
PhenylalaninePheFpI 5.48ไม่มีขั้ว / อะโรมาติกสารตั้งต้นไทโรซีน, วิถีแคทีโคลามีนพลาสมา, DBS (การคัดกรองทารกแรกเกิด)LC-MS/MS (MRM); ตรวจวัดด้วย UV ที่ 254 nm เป็นตัวเลือกเสริม
ThreonineThrTpI 5.87มีขั้วไม่ประจุจุด O-linked glycosylation, สารตั้งต้นไกลซีนพลาสมา, อาหาร, อาหารหมักLC-MS/MS หรือ AQC derivatization-HPLC
TryptophanTrpWpI 5.89ไม่มีขั้ว / อะโรมาติก (indole)วิถีเซโรโทนิน/ไคนูเรนีน, สังเคราะห์ NAD+พลาสมา, CSF, อาหารเลี้ยงเชื้อLC-MS/MS หรือ HPLC พร้อมตรวจวัดฟลูออเรสเซนซ์; ป้องกันแสง
ValineValVpI 5.96ไม่มีขั้ว / ไม่ชอบน้ำBCAA; gluconeogenesis, ความสมบูรณ์ของเยื่อบุทางเดินอาหารพลาสมา, ชิ้นเนื้อกล้ามเนื้อ, อาหารเลี้ยงเชื้อLC-MS/MS (MRM); ตรวจสอบการพีกซ้อนกับลิวซีนบน C18

กรณีศึกษาวิจัยที่มีความสำคัญสูง

การวิเคราะห์ BCAA ในวิทยาศาสตร์การกีฬาและโภชนาการทางคลินิกต้องอาศัยการแยกลิวซีน, ไอโซลิวซีน และวาลีนอย่างแม่นยำ เนื่องจากลิวซีนและไอโซลิวซีนมีมวลใกล้เคียงกันมาก การใช้ MRM transition ที่ความละเอียดต่ำจึงไม่เพียงพอ ควรใช้ high-resolution MS หรือตรวจสอบให้แน่ใจว่าเกิดการแยกทางโครมาโทกราฟีที่สมบูรณ์เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน การศึกษาเกี่ยวกับการจำกัดเมทไทโอนีนต้องการความไวในระดับต่ำระดับ picomolar ในอาหารเลี้ยงเชื้อ เนื่องจากสภาวะที่จำกัดจะลดความเข้มข้นลงจนใกล้หมด

เวิร์กโฟลว์การดัดแปรหลังการแปลรหัส (PTM) ของไลซีน มักติดตามการดัดแปรฮิสโตนด้วยโปรตีโอมิกส์ แต่การติดตามไลซีนอิสระควบคู่กันจะช่วยยืนยันว่าปริมาณสารอาหารไม่จำกัดการทำงานของเอนไซม์ การวิเคราะห์การสลายตัวของทริปโตเฟนในภูมิคุ้มกันวิทยามักวัดทริปโตเฟนร่วมกับไคนูเรนีน, กรดไคนูเรนิก และกรดควิโนลินิก สารมาตรฐาน Amino Acid ที่รับรองสำหรับสารวิเคราะห์แต่ละตัวจะช่วยให้การเตรียมการสอบเทียบง่ายขึ้นโดยปราศจากความเสี่ยงจากความผิดพลาดของความเข้มข้นจากการเตรียมสารละลายผสมเอง

สำหรับการทำ method validation และ system suitability สารมาตรฐาน Amino Acid Reference Materials จาก Merck มีสารมาตรฐานที่รับรองสำหรับการวิเคราะห์ GC/MS และ LC/MS อย่างแม่นยำ พร้อมเอกสารการสอบกลับได้ที่จำเป็นสำหรับงานภายใต้ข้อกำหนดและการตีพิมพ์ผลงานทางวิชาการ

เคล็ดลับด่วน: การเตรียมตัวอย่างสำหรับกรดอะมิโนจำเป็น

  • ป้องกันทริปโตเฟนจากแสงทุกขั้นตอน: ห่อหลอดทดลอง ทำงานให้รวดเร็ว และเก็บสารสกัดที่ -80°C
  • ป้องกันการเกิดออกซิเดชันของเมทไทโอนีนโดยลดการสัมผัสอากาศ เติมแอสคอร์บิกแอซิดหรือ dithiothreitol หากวิธีการวิเคราะห์ปลายทางรองรับ
  • ใช้การตกตะกอนโปรตีนด้วย acetonitrile หรือเมทานอลก่อนทำ LC-MS เพื่อลด ion suppression จากเมทริกซ์
  • เลือกใช้ OPA หรือ FMOC derivatization เพื่อความจำเพาะต่อเอมีนปฐมภูมิ และใช้ AQC หรือ PITC สำหรับชุดการวิเคราะห์ที่ครอบคลุมเอมีนทุติยภูมิด้วย
  • ตรวจสอบ recovery ตลอดขั้นตอน cation-exchange SPE ด้วยตัวอย่าง QC ที่เติมสารมาตรฐานใน 3 ระดับความเข้มข้น
  • ทำการทดสอบ system suitability ด้วยสารผสมกรดอะมิโนที่รับรองก่อนเริ่มแต่ละ Batch ของการวิเคราะห์

กลยุทธ์โครมาโทกราฟีและแมสสเปกโทรเมทรีสำหรับการวิเคราะห์กรดอะมิโน

แนวทางหลัก 3 ประการครอบคลุมความต้องการส่วนใหญ่ของห้องปฏิบัติการในการวัดปริมาณกรดอะมิโนจำเป็น ได้แก่ LC-MS หรือ LC-MS/MS แบบไม่ผ่านการทำ derivatization, การทำ pre-column derivatization ร่วมกับ HPLC-FLD หรือ UV, และ GC-MS หลังจากทำ derivatization ทางเคมีเพื่อให้ได้อนุพันธ์ที่ระเหยได้

วิธีวิเคราะห์ใดที่เหมาะสมกับห้องปฏิบัติการของคุณ?

LC-MS/MS (HILIC หรือ mixed-mode แบบไม่ทำ derivatization)
  • ความไวและความจำเพาะสูงที่สุดสำหรับพลาสมาและอาหารเลี้ยงเชื้อ
  • ไม่ต้องทำขั้นตอน derivatization ลดเวลาเตรียมและลดความเสี่ยงด้านเสถียรภาพ
  • เหมาะสำหรับ Isotope tracing ด้วยกรดอะมิโนที่ติดฉลาก
  • ต้องใช้เฟสเคลื่อนที่ที่ระเหยง่าย เช่น formate หรือ acetate
  • ความพร้อมของเครื่องมืออาจเป็นข้อจำกัดในห้องปฏิบัติการควบคุมคุณภาพในไทยบางแห่ง
HPLC พร้อม pre-column derivatization (OPA, FMOC, AQC)
  • เข้ากันได้กับคอลัมน์ C18 เดิมและเครื่องตรวจวัดฟลูออเรสเซนซ์
  • ต้นทุนเครื่องมือต่ำกว่า เป็นมาตรฐานในห้องปฏิบัติการอาหารและคลินิก
  • น้ำยา AQC ให้สารอนุพันธ์ที่เสถียร ส่วน OPA ต้องฉีดตัวอย่างทันที
  • เหมาะสำหรับงานควบคุมคุณภาพทางโภชนาการและการตรวจสอบฉลากผลิตภัณฑ์
  • เอมีนทุติยภูมิบางชนิดต้องมีขั้นตอน derivatization เพิ่มเติม
GC-MS หลังการทำ derivatization
  • ได้รับการยอมรับทางกฎระเบียบอย่างกว้างขวางในด้านอาหารและนิติเวช
  • มีความจำเพาะสูงด้วยการค้นหาจากห้องสมุดสเปกตรัม (library matching)
  • ใช้เวลา derivatization และ run time นานกว่า LC-MS
  • ความไวต่อความชื้นของสารอนุพันธ์อาจเป็นปัญหาในสภาพอากาศชื้น
  • ไม่เหมาะสำหรับการวิเคราะห์จำนวนมากในทางคลินิก เหมาะสำหรับงานยืนยันผล

อ้างอิงการตั้งค่าวิธีการ

ตารางด้านล่างให้คู่มือการตั้งค่าแบบกระชับสำหรับ 2 รูปแบบที่ใช้บ่อยที่สุดในงานวิจัยและงานควบคุมคุณภาพของไทย

พารามิเตอร์HILIC LC-MS/MS (ไม่ทำ derivatization)C18 HPLC-FLD (AQC derivatization)
ประเภทคอลัมน์ / ขนาดอนุภาคHILIC หรือ mixed-mode zwitterionic, 1.7-3.5 µmC18 reversed-phase, 3.5-5 µm
เฟสเคลื่อนที่ A10 mM ammonium formate ในน้ำ, pH 3.0-3.550 mM sodium acetate buffer, pH 5.05-5.15
เฟสเคลื่อนที่ BAcetonitrile พร้อม 0.1% formic acidAcetonitrile/น้ำ (60:40 v/v)
Gradient / isocraticGradient: เริ่มจาก organic สูง แล้วเปลี่ยนเป็น aqueousGradient: 0-10% B ในเวลา 30-40 นาที
ตัวทำละลายสำหรับฉีด80% acetonitrile / 20% น้ำ (ตามสภาวะเริ่มต้นของคอลัมน์)Borate buffer หรือตัวทำละลายสำหรับละลาย AQC
ตัวอย่าง MRM (leucine)132.1 → 86.1 (positive mode)ไม่มี (ใช้การตรวจวัดฟลูออเรสเซนซ์)
ช่วง LOD ทั่วไป0.1-1 µM ในสารสกัดพลาสมา1-5 pmol บนคอลัมน์

การจัดการกับผลของเมทริกซ์และ ion suppression

ความเสี่ยงของ ion suppression: บัฟเฟอร์ฟอสเฟต อาหารเลี้ยงเชื้อที่มีเกลือสูง และโปรตีนตกค้าง จะรบกวนการแตกตัวเป็นไอออนของกรดอะมิโนในแหล่ง ESI ควรเปลี่ยนมาใช้บัฟเฟอร์ที่ระเหยง่าย เช่น ammonium formate หรือ formic acid สำหรับสารวิเคราะห์ทุกชนิดในชุดกรดอะมิโนจำเป็น ควรใช้ stable isotope-labeled internal standard หากงบประมาณจำกัด ควรเลือกใช้ตัวมาตรฐานที่ติดฉลากครอบคลุมช่วงความเป็นขั้วและ retention range และต้องตรวจสอบปัจจัยการแก้ไขค่าของสารวิเคราะห์แต่ละตัว

สำหรับเวิร์กโฟลว์ที่ใช้อนุพันธ์ติดฉลากไอโซโทป Merck stable isotope labeled amino acid mixes นำเสนอวัสดุอ้างอิงรับรองที่ออกแบบมาสำหรับการวิเคราะห์ Mass Spectrometry ขั้นสูง ช่วยลดเวลาในการตรวจสอบความบริสุทธิ์ของไอโซโทปด้วยตนเอง

การเลือกเตรียมตัวอย่าง

การตกตะกอนโปรตีนด้วย acetonitrile (3:1 v/v) หรือเมทานอล (2:1 v/v) ให้ผลการกำจัดโปรตีนที่เพียงพอสำหรับพลาสมาและอาหารเลี้ยงเชื้อส่วนใหญ่ ควรปั่นเหวี่ยงที่ 14,000 x g เป็นเวลา 10 นาทีแล้วนำส่วนใส (supernatant) ออกมาโดยเก็บรักษาในที่เย็น หลีกเลี่ยงน้ำยาตกตะกอนที่มีฟอสเฟตหากสารสกัดจะนำไปตรวจวัดด้วย MS โดยตรง

Cation-exchange SPE ช่วยในการทำความสะอาดเพิ่มเติมสำหรับตัวอย่างอาหารไฮโดรไลเซตและอาหารหมักที่มีเกลือสูง ชะกรดอะมิโนออกด้วย 2 M แอมโมเนียใน 20% ไอโซโพรพานอล และทำให้แห้งภายใต้ก๊าซไนโตรเจนก่อนละลายใหม่ ควรตรวจสอบ recovery ในระดับ QC ต่ำ กลาง และสูง เนื่องจากความสามารถในการจับกับ SPE sorbent ขึ้นอยู่กับค่า pKa ของกรดอะมิโน

หลังจากทำ derivatization ความเสถียรจะขึ้นอยู่กับน้ำยา: อนุพันธ์ AQC มักจะเสถียรที่อุณหภูมิห้องได้ 24-48 ชั่วโมง ในขณะที่อนุพันธ์ OPA ต้องฉีดวิเคราะห์ภายใน 1-2 นาที เตรียมสารอนุพันธ์เป็น Batch ให้สอดคล้องกับแผนการวิเคราะห์ และเก็บสารสกัดที่ยังไม่ผ่านการ derivatization ที่ -80°C หากไม่สามารถวิเคราะห์ได้ภายในวันเดียวกัน

สรุปและก้าวต่อไป

กรดอะมิโนจำเป็นคือ 9 ชนิดที่เซลล์มนุษย์ไม่สามารถผลิตได้ในปริมาณที่เพียงพอ ได้แก่ ฮิสทิดีน, ไอโซลิวซีน, ลิวซีน, ไลซีน, เมทไทโอนีน, ฟีนิลอะลานีน, ทรีโอนีน, ทริปโตเฟน และวาลีน ซึ่งเป็นตัวแปรควบคุมในการศึกษาโภชนาการ การเพาะเลี้ยงเซลล์ และการทดลอง metabolic flux การเลือกระหว่าง LC-MS/MS, HPLC พร้อม derivatization หรือ GC-MS ขึ้นอยู่กับเมทริกซ์ เป้าหมายความไว และเครื่องมือที่มี

เส้นทางสู่ผลสำเร็จทำได้ไม่ยาก จับคู่เครื่องมือที่มีให้เข้ากับวิธีวิเคราะห์ จัดหาสารมาตรฐาน Amino Acid และ internal standard ที่ติดฉลากไอโซโทปก่อนเริ่มพัฒนาระบบ บันทึกความเข้มข้นที่เติม ระยะเวลา derivatization แหล่งที่มาของเมทริกซ์ และสภาวะการจัดเก็บในบันทึกวิธีการ เพื่อให้ข้อมูลมีความน่าเชื่อถือเมื่อมีการทบทวน

Chemical Express Thailand เป็นผู้จัดจำหน่ายสารมาตรฐานกรดอะมิโน สารอนุพันธ์ และวัสดุอ้างอิงจาก Merck (Sigma-Aldrich) และ TCI สำหรับห้องปฏิบัติการในไทย ติดต่อเราเพื่อตรวจสอบความพร้อมของสินค้า ระยะเวลาจัดส่ง เอกสาร Certificate of Analysis และ Safety Data Sheets สำหรับความต้องการเฉพาะของชุดการวิเคราะห์ของคุณ

คำถามที่พบบ่อย

จำเป็นต้องทำ derivatization เพื่อวัดปริมาณกรดอะมิโนอิสระด้วย LC-MS หรือไม่?
ไม่เสมอไป HILIC หรือ mixed-mode LC-MS/MS สามารถวัดปริมาณกรดอะมิโนโดยไม่ต้องทำ derivatization ได้โดยตรงเมื่อใช้คู่กับ internal standard ที่ติดฉลากไอโซโทปที่เหมาะสม การทำ derivatization ช่วยให้กรดอะมิโนค้างบนคอลัมน์ C18 ได้ดีขึ้นและเพิ่มความไวในการตรวจวัดฟลูออเรสเซนซ์ แต่ต้องแลกมาด้วยเวลาเตรียมและการควบคุมความเสถียรของอนุพันธ์ที่ต้องผ่านการตรวจสอบ
ควรใช้ internal standard ชนิดใดสำหรับการวิเคราะห์ชุดกรดอะมิโน?
อนุพันธ์ที่ติดฉลากไอโซโทปที่ตรงกับสารวิเคราะห์แต่ละชนิดให้การแก้ไขผลกระทบจากเมทริกซ์และค่าความแปรปรวนของ recovery ได้น่าเชื่อถือที่สุด หากงบประมาณจำกัด ให้ใช้ตัวแทนที่ติดฉลากซึ่งครอบคลุมช่วงความเป็นขั้วและระยะเวลา retention ของชุดสารวิเคราะห์นั้นๆ แต่ต้องตรวจสอบและบันทึกปัจจัยการแก้ไขค่าของสารวิเคราะห์แต่ละชนิด
วิธีป้องกันการเสื่อมสภาพของเมทไทโอนีนและทริปโตเฟนระหว่างเตรียมตัวอย่าง?
ทำงานในที่เย็น ลดการสัมผัสแสงสำหรับทริปโตเฟนในทุกขั้นตอน และรักษาเวลาในการทำ derivatization ให้สั้นที่สุดเท่าที่จะทำได้ เติมแอสคอร์บิกแอซิดหรือสารต้านอนุมูลอิสระที่เข้ากันได้เพื่อปกป้องเมทไทโอนีน และควรใส่ตัวอย่าง QC ที่บันทึกเวลาไว้ใน Batch การวิเคราะห์เพื่อเฝ้าระวังความเสถียรก่อนที่ปัญหาจะกระทบต่อผลลัพธ์
เมทริกซ์ใดที่ท้าทายที่สุดสำหรับการวิเคราะห์กรดอะมิโน?
เมทริกซ์ที่มีโปรตีนและเกลือสูง เช่น พลาสมา, ซีรัม และน้ำหมัก จะก่อให้เกิด ion suppression อย่างรุนแรงและการปนเปื้อนข้าม (carryover) การตกตะกอนโปรตีนตามด้วยการทำความสะอาดด้วย SPE ร่วมกับการเปลี่ยนไปใช้บัฟเฟอร์ที่ระเหยง่ายจะช่วยลดความเสี่ยงเหล่านี้ลงได้อย่างมาก ควรทำการทดลอง post-column infusion หรือ spike-recovery ในเมทริกซ์จริงเสมอก่อนตัดสินใจใช้วิธีนั้น
ควรใช้จุด Calibrator และ QC จำนวนเท่าใดสำหรับวิธีวิเคราะห์ที่มีการควบคุม?
การใช้ Calibrator 6 ถึง 9 จุดที่ไม่เป็นศูนย์ ครอบคลุมช่วงความเข้มข้นที่คาดว่าจะพบ พร้อมด้วยตัวอย่าง QC ระดับต่ำ กลาง และสูงที่วิเคราะห์ซ้ำ (duplicate) เป็นแนวปฏิบัติทั่วไปสำหรับวิธีวิเคราะห์ทางชีวภาพ (bioanalytical methods) ควรปรับระบบให้สอดคล้องกับแนวทางที่เกี่ยวข้อง (เช่น EMA หรือ FDA bioanalytical guidance) และตรวจสอบ system suitability ในช่วงเริ่มต้นของแต่ละ Batch รวมถึงใช้ Blank และ Zero calibrator เพื่อยืนยันว่าไม่มีสารรบกวน

ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ

ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค

ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express

เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ Amino Acid Fundamentals จาก Merck, TCI และ MedChemExpress (MCE) และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE

en_USEnglish

Privacy Overview

This website uses cookies so that we can provide you with the best user experience possible. Cookie information is stored in your browser and performs functions such as recognising you when you return to our website and helping our team to understand which sections of the website you find most interesting and useful.