His-Tag Protein Purification คืออะไร? หลักการและการประยุกต์ใช้
เมื่อคุณต้องการโปรตีนที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์จาก E. coli หรือ lysate ของเซลล์ HEK และเวลาที่มีอยู่อย่างจำกัด การเลือกบัฟเฟอร์ ไอออนของโลหะ หรือความเข้มข้นของ imidazole ที่ไม่เหมาะสมอาจส่งผลต่อปริมาณโปรตีนที่ได้รับ ความบริสุทธิ์ หรือความเข้ากันได้กับการวิเคราะห์ในขั้นถัดไป บทความนี้จะพาคุณไปทำความเข้าใจว่า His-tag protein purification principle คืออะไร รวมถึงขั้นตอนการทำงาน องค์ประกอบสำคัญ และหลักการเลือกใช้ His-tag เทียบกับ tag รูปแบบอื่นๆ
His-tag purification คืออะไร ในแง่มุมที่เข้าใจง่าย?
His-tag protein purification คือวิธีการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์โดยอาศัยหลักการ Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) ซึ่งจะจับโปรตีนรีคอมบิแนนท์ (recombinant proteins) ที่มี His-tag เข้ากับเรซินที่มีประจุ Ni2+ หรือ Co2+ แล้วจึงทำการชะออกด้วย imidazole หรือการปรับค่า pH วิธีนี้มีความรวดเร็ว สามารถทำได้โดยตรงจาก crude lysate และใช้สภาวะที่ไม่รุนแรงซึ่งช่วยรักษาฤทธิ์ของโปรตีนได้เป็นอย่างดี อีกทั้งยังสามารถขยายสเกลงานได้ง่าย ตั้งแต่การใช้ spin column ไปจนถึงการใช้งานกับระบบ FPLC ที่เป็นระบบอัตโนมัติ โดยไม่จำเป็นต้องปรับเปลี่ยนโปรโตคอลหลักมากนัก
ในเชิงปฏิบัติ His-tag purification เป็นขั้นตอนที่อยู่ระหว่างการ lysis/clarification และขั้นตอนการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ขั้นสุดท้าย (polishing) วิธีนี้เข้ากันได้ดีกับการตรวจสอบ Fraction ด้วย SDS-PAGE, การวิเคราะห์เอนไซม์ และวิธีวิเคราะห์ส่วนใหญ่ หลักการทำ His-tag protein purification คือการจับกันอย่างจำเพาะระหว่าง side chain ของ histidine imidazole และไอออนของโลหะที่ถูก chelate อยู่บนเรซิน หากต้องการดูข้อมูลเพิ่มเติมว่า affinity chromatography เป็นพื้นฐานของวิธีที่ใช้ tag ต่างๆ อย่างไร โปรดดูที่ Affinity Chromatography for Protein Purification: How It Works
His-tag protein purification principle: IMAC จับโปรตีนที่มี His-tag ได้อย่างไร
หลักการของ His-tag protein purification อาศัยเคมีของการจับกันโดยตรง วงแหวน histidine imidazole จะจับกับไอออน Ni2+ หรือ Co2+ ที่ถูกจับโดยลิแกนด์ NTA (nitrilotriacetic acid) หรือ IDA (iminodiacetic acid) บนเรซิน การจับจะมีประสิทธิภาพสูงสุดที่ pH 7.5 ถึง 8.0 โดยมีค่าความแรงของไอออน (ionic strength) อยู่ที่ประมาณ 300 mM NaCl เพื่อลดการจับที่ไม่จำเพาะ (nonspecific interaction)
การชะโปรตีนออก (elution) อาศัยการแข่งขัน โดย imidazole อิสระในบัฟเฟอร์จะเข้ามาแย่งจับกับตำแหน่งของโลหะ การใช้ imidazole แบบ step หรือ gradient จาก 50 mM ถึง 500 mM จะทำให้โปรตีนเป้าหมายค่อยๆ แยกตัวออกมาและถูกเก็บรวบรวม หากความเสถียรของโปรตีนเป็นเรื่องที่น่ากังวล การปรับ pH ให้ลดลงเล็กน้อยสามารถช่วยชะโปรตีนออกโดยลดการสัมผัสกับ imidazole ได้
Ni2+ vs Co2+: การเลือกที่ตอบโจทย์เป้าหมายโครงการของคุณ
ไอออนของโลหะที่คุณเลือกจะกำหนดสมดุลระหว่างความบริสุทธิ์และความจุของเรซิน (binding capacity) เรซินประเภท Ni2+ มักมีความจุในการจับสูงกว่า จึงเหมาะสำหรับตัวอย่างที่มีปริมาณจำกัดหรือการทดลองเบื้องต้น ส่วนเรซินประเภท Co2+ มักให้ความบริสุทธิ์ที่สูงกว่าเนื่องจากช่วยลดการปนเปื้อนของโปรตีนจากเซลล์เจ้าบ้านที่มี histidine สูง ซึ่งมีความสำคัญมากเมื่อเตรียมตัวอย่างสำหรับงานด้านโครงสร้างโปรตีนหรือการวิเคราะห์ที่ต้องการความไวสูง
คุณไม่จำเป็นต้องใช้เรซินประเภทเดียวไปตลอด หลายห้องปฏิบัติการนิยมเริ่มด้วย Ni2+ เพื่อความรวดเร็ว แล้วจึงเปลี่ยนไปใช้ Co2+ เมื่อโครงการมุ่งเน้นไปที่การผลิตในสเกลที่ต้องการความสะอาดมากขึ้น
สารเติมแต่งในบัฟเฟอร์ เช่น กลีเซอรอล, สารซักฟอกชนิดไม่มีประจุ (nonionic detergent) และสารรีดิวซ์ (reducing agent) แบบอ่อน (เช่น 1 ถึง 5 mM beta-mercaptoethanol หรือ TCEP) มักใช้ได้ดีกับสภาวะ IMAC อย่างไรก็ตามควรตรวจสอบสารเติมแต่งแต่ละชนิดในสเกลขนาดเล็กก่อนเริ่มการทดลองเต็มรูปแบบ ทั้งค่า pH, เกลือ และสารเติมแต่ง ต่างส่งผลต่อความแข็งแรงในการจับและประสิทธิภาพการชะออกของโปรตีน
สำหรับรูปแบบเรซิน Ni หรือ Co ที่พร้อมใช้งานพร้อมบัฟเฟอร์สำหรับ Binding, Wash และ Elution ที่เหมาะกับงานวิจัยในประเทศไทย สามารถดูรายละเอียดเพิ่มเติมได้ที่กลุ่มผลิตภัณฑ์ Recombinant/Fusion Tag Protein Purification ชุดคิทเหล่านี้จะช่วยลดความยุ่งยากในการเตรียมบัฟเฟอร์และลดเวลาในการพัฒนาวิธีทดลองได้อย่างมาก
สำหรับข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับวิธีที่ลิแกนด์และความเป็นเคมีของเรซินโต้ตอบกันในระบบ tag ต่างๆ ดูได้ที่ Affinity Chromatography คืออะไร? ใช้ Purify Protein ที่มี Tag อย่างไร
องค์ประกอบสำคัญและขั้นตอนการทำงาน ตั้งแต่ lysis ไปจนถึง elution และ polish
ความสำเร็จของ His-tag purification ขึ้นอยู่กับการมีองค์ประกอบที่ถูกต้องพร้อมใช้งานก่อนเริ่มทดลอง ความต้องการหลักประกอบด้วยเรซิน Ni-NTA หรือ Co หรือคาร์ทริดจ์สำเร็จรูป บัฟเฟอร์ที่มีความเข้มข้นของ imidazole ที่ชัดเจนในแต่ละขั้นตอน lysate ที่ใสปราศจากอนุภาค และวิธีการตรวจสอบ fraction เช่น การวัดค่าดูดกลืนแสงที่ A280 และ SDS-PAGE
องค์ประกอบของบัฟเฟอร์ในแต่ละขั้นตอนเป็นไปตามรูปแบบที่ชัดเจน: binding buffer ที่ pH 7.5 ถึง 8.0 พร้อม 300 mM NaCl และ 5 ถึง 20 mM imidazole; wash buffer ที่มี 20 ถึง 40 mM imidazole; และ elution buffer ที่ 250 ถึง 500 mM imidazole วางแผนการเปลี่ยนบัฟเฟอร์ทันทีหลังการชะออกหากการวิเคราะห์ขั้นถัดไปของคุณไวต่อ imidazole สำหรับขั้นตอนเตรียมตัวอย่างรวมถึงน้ำยา lysis และน้ำยาตัดสาย DNA ที่ปกป้องประสิทธิภาพของเรซิน กลุ่มผลิตภัณฑ์ Protein Sample Prep มีเครื่องมือที่เข้ากันได้ซึ่งรวมเข้ากับ workflow นี้ได้โดยตรง
ขั้นตอนการทำงานและพารามิเตอร์
Lysis และการทำให้ใส (Clarification)
ทำการ Lyse เซลล์ใน binding buffer หากทำงานกับแบคทีเรียให้เติม lysozyme และ DNase เพื่อลดความหนืด รักษาสภาพตัวอย่างให้เย็นตลอดเวลาเพื่อจำกัดการทำงานของโปรตีเอส ทำให้สารละลายใสโดยการเหวี่ยงแยก (centrifugation) ตามด้วยการกรองผ่านเมมเบรนขนาด 0.45 หรือ 0.22 µm เพื่อขจัดเศษซากเซลล์และปกป้องเรซิน
การจับและการโหลดตัวอย่าง (Binding and loading)
ปรับสมดุลเรซินล่วงหน้าด้วย binding buffer อย่างน้อย 5 เท่าของปริมาตรคอลัมน์ (column volume) โหลด lysate ที่ใสแล้วด้วยอัตราการไหลที่เหมาะสมเพื่อให้มีเวลาในการจับเพียงพอ ติดตามผล outflow ของคอลัมน์โดย A280 เพื่อตรวจดูการไหลผ่านของโปรตีนก่อนเวลาอันควร ห้ามใส่เกินความจุที่เรซินระบุไว้ เนื่องจากการบรรจุเกิน (overloading) จะลดความบริสุทธิ์และการกู้คืนโปรตีน
การล้างและการชะ (Wash and elution)
ใช้ wash buffer ปริมาตร 5 ถึง 10 column volumes ที่ความเข้มข้น 20 ถึง 40 mM imidazole เพื่อขจัดสิ่งปนเปื้อนที่จับอยู่อย่างหลวมๆ ชะโปรตีนออกด้วย step หรือ gradient สูงสุดที่ 250 ถึง 500 mM imidazole โดยเก็บ fraction ขนาดเล็ก ตรวจสอบ fraction ทันทีด้วย SDS-PAGE หรือ A280 เพื่อระบุพีกและยืนยันความบริสุทธิ์ก่อนรวมโปรตีน
การทำความสะอาดและเปลี่ยนบัฟเฟอร์ (Polish and buffer exchange)
กำจัด imidazole และทำให้โปรตีนเข้มข้นขึ้นด้วยการกรองพิเศษ (ultrafiltration) อุปกรณ์ Amicon® Ultrafiltration Devices สามารถจัดการทั้งการกำจัด imidazole และการทำให้เข้มข้นในขั้นตอนเดียว ช่วยประหยัดเวลาก่อนนำไปเก็บหรือทดสอบ เลือกเมมเบรนที่มี MWCO ต่ำกว่าน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน 3 ถึง 10 เท่าเพื่อการเปลี่ยนบัฟเฟอร์ที่มีประสิทธิภาพ
การเข้าใจหลักการ His-tag protein purification ช่วยให้กำหนดระดับ imidazole และอัตราการไหลที่เหมาะสมซึ่งสร้างสมดุลระหว่างความบริสุทธิ์และปริมาณโปรตีนในแต่ละขั้นตอนของการทดลอง
เคล็ดลับด่วน
- รักษา pH ให้คงที่และรักษาสภาพตัวอย่างให้เย็นตลอดการทดลอง
- เติมกลีเซอรอล 5 ถึง 10 เปอร์เซ็นต์ลงในบัฟเฟอร์สำหรับโปรตีนที่ไวต่อสภาวะหรือเกิดการรวมตัวได้ง่าย
- ผสมเรซินอย่างเบามือด้วยการกลับหัว ไม่แนะนำให้ใช้เครื่อง vortex เพื่อหลีกเลี่ยงเศษเล็กๆ ที่จะทำให้ backpressure เพิ่มสูงขึ้น
- ใส่สารซักฟอกชนิดไม่มีประจุ 0.05 เปอร์เซ็นต์ลงใน wash buffer หากมีการปนเปื้อนของโปรตีนเจ้าบ้านสูงและตัวสารซักฟอกเข้ากันได้กับการวิเคราะห์
- เปลี่ยนไปใช้เรซิน Co2+ เมื่อการรัน Ni2+ ทำให้เกิดแถบ background ที่ไม่ต้องการบน SDS-PAGE
- อย่าเกินความจุที่ระบุโดยผู้ผลิต (mg His-tagged protein ต่อ mL เรซิน) เพื่อรักษาความบริสุทธิ์
การประยุกต์ใช้และเมื่อไหร่ที่ควรเลือก His-tag เทียบกับ tag อื่น
การทำ His-tag purification ครอบคลุมการใช้งานวิจัยที่หลากหลาย การใช้งานทั่วไปรวมถึงการคัดกรอง expression construct หลายตัวแบบขนาน, การผลิตโปรตีนเพื่อศึกษาจลนศาสตร์ของเอนไซม์หรือการวิเคราะห์โครงสร้าง, การผลิตแอนติเจนเพื่อสร้างแอนติบอดีและการพัฒนาวิธีวินิจฉัย และการทดลอง pull-down เพื่อทำแผนที่ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีน
เมื่อไหร่ที่ His-tag เป็นตัวเลือกที่เหมาะสม
His-tag ใช้งานได้อย่างน่าเชื่อถือในทั้ง lysate ของแบคทีเรียและสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ทนต่อสารซักฟอกชนิดไม่มีประจุ สารรีดิวซ์ และกลีเซอรอลโดยไม่สูญเสียความสามารถในการจับ โปรโตคอลชุดเดียวกันสามารถใช้ได้ทั้งในสภาวะปกติและสภาวะ denaturing (urea หรือ guanidine) ทำให้ใช้งานได้จริงเมื่อ inclusion bodies จำเป็นต้องถูกละลายก่อนจับโปรตีน นอกจากนี้ยังสามารถปรับสเกลจากการใช้ spin column 1 mL ไปจนถึงการรัน FPLC แบบหลาย mL ได้อย่างราบรื่น
หากระบบ expression ของคุณมักเกิด inclusion bodies การใช้ IMAC ควบคู่ไปกับขั้นตอนการละลายและการทำให้โปรตีนกลับมาคืนรูป (refolding) สามารถกู้คืนโปรตีนที่ใช้งานได้ก่อนเข้าสู่ขั้นตอน purification ดูที่ Merck Chemicals for Recovering Active Proteins from Bacterial Inclusion Bodies สำหรับแนวทางที่เข้ากันได้กับความท้าทายนี้
เมื่อไหร่ที่ควรพิจารณา FLAG-tag หรือ Strep-tag แทน
FLAG-tag เป็นทางเลือกที่ดีกว่าเมื่อคุณต้องการการตรวจวัดโดยใช้แอนติบอดีโดยตรงใน workflow ของ Western blot หรือ co-immunoprecipitation วิธีนี้หลีกเลี่ยงเคมีของไอออนโลหะโดยสิ้นเชิง ซึ่งสำคัญเมื่อโปรตีนเป้าหมายมี metal-binding domain หรือ metalloprotein cofactor ที่อาจรบกวนประสิทธิภาพของเรซิน IMAC สำหรับตัวเลือกการจับและการชะออกที่ใช้ FLAG, กลุ่มผลิตภัณฑ์ FLAG Purification มีทางเลือกที่ปราศจากโลหะภายในระบบ affinity chromatography เดียวกัน
Strep-tag และ affinity tag ขนาดเล็กอื่นๆ เหมาะสำหรับ workflow ที่ต้องการความจำเพาะสูงมากและการชะออกที่นุ่มนวล โดยเฉพาะในระบบของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มักมี cofactor ที่ไวต่อโลหะ
คำแนะนำในการตัดสินใจ: His-tag vs FLAG-tag vs Strep-tag
- การ expression ในแบคทีเรียหรือสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม, การคัดกรองที่รวดเร็ว
- สภาวะ lysis แบบ native หรือ denaturing
- การรันแบบเตรียมสารปริมาณมากบน FPLC
- โครงการที่คำนึงถึงงบประมาณและต้องการเรซินราคาประหยัด
- การศึกษาฤทธิ์ของเอนไซม์หรือโครงสร้างสำหรับเป้าหมายที่ปราศจากโลหะ
- Workflow แบบ Western blot หรือ co-IP ที่ใช้แอนติบอดี
- โปรตีนที่ไวต่อโลหะหรือ metalloprotein
- การทำ IP ที่มีความเข้มข้นสูงจาก lysate ที่ซับซ้อนของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม
- โครงการที่ต้องใช้การ QC ด้วยแอนติบอดีพร้อมน้ำยาตรวจจับ tag
- ความบริสุทธิ์สูงมากพร้อมการชะออกที่นุ่มนวลโดยใช้ streptavidin
- โปรตีนที่มี metal cofactor
- การ expression ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมหรือ cell-free สำหรับเป้าหมายที่ละเอียดอ่อน
- การใช้งานที่สามารถยอมรับการชะออกโดยการแข่งขันกับไบโอตินได้
หลังจากการทำ purification ด้วยวิธี tag ใดก็ตาม การยืนยันการปรากฏของ tag และตัวตนของโปรตีนเป็นแนวปฏิบัติที่ดี Tag and Control Antibodies จาก TCI รวมถึง Anti-6xHis Monoclonal Antibody (6A12) Biotin Conjugate (A3010) และ Anti-6xHis Monoclonal Antibody (6A12) HRP Conjugate (A3075) ช่วยให้คุณตรวจสอบปริมาณและความถูกต้องของ His-tagged protein ได้โดยตรงด้วย Western blot โดยไม่ต้องจัดหาเครื่องมือตรวจจับแยกต่างหาก การเตรียมเครื่องมือยืนยันผลเหล่านี้ให้พร้อมก่อนรันงานจริงจะช่วยป้องกันความสูญเปล่าในกรณีที่ผลผลิตโปรตีนต่ำ
สำหรับ workflow การทำแอนติบอดีให้บริสุทธิ์ที่ต้องใช้แพลตฟอร์ม affinity แยกต่างหาก ดูที่ Protein A Purification Resins and Buffers by Merck สำหรับวิธีการจับแบบ Fc-based ที่มีข้อควรพิจารณาเรื่องบัฟเฟอร์และเรซินเฉพาะตัว
คำแนะนำเชิงปฏิบัติ: ทดสอบตัวเลือก tag อย่างน้อยสองอย่างในระหว่างขั้นตอนการออกแบบ construct จัดอันดับตามความบริสุทธิ์บน SDS-PAGE, ฤทธิ์จำเพาะในการวิเคราะห์หลัก, ปริมาณต่อลิตรของ culture และความเข้ากันได้กับบัฟเฟอร์เก็บรักษาและวิเคราะห์สุดท้าย tag ที่ได้คะแนนสูงสุดจากทั้งสี่เกณฑ์คือผู้ชนะ
สรุปทางเทคนิคและตารางอ้างอิงด่วน
ตารางด้านล่างสรุปหลักการ His-tag protein purification ในแง่ของบัฟเฟอร์และเรซินที่ใช้จริง ใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงเบื้องต้นจากนั้นปรับความเข้มข้นของ imidazole และสารเติมแต่งตามพฤติกรรมของโปรตีนเป้าหมายในระดับสเกลเล็ก สำหรับเครื่องมือด้าน Protein Biology ที่เข้ากันได้ทั้งหมดซึ่งใช้ก่อนและหลัง IMAC รวมถึงน้ำยา lysis, เอ็นไซม์นิวคลีเอส และอุปกรณ์ทำความเข้มข้น โปรดดูภาพรวมผลิตภัณฑ์ที่ Chemical Express Thailand
| ขั้นตอนบัฟเฟอร์ | pH | NaCl (mM) | Imidazole (mM) | สารเติมแต่ง / หมายเหตุ |
|---|---|---|---|---|
| Binding | 7.5 to 8.0 | 300 | 5 to 20 | ทางเลือก: 0.05% Tween-20, 1 to 5 mM TCEP หรือ BME, 5 to 10% glycerol ห้ามใช้ EDTA |
| Wash | 7.5 to 8.0 | 300 | 20 to 40 | เพิ่ม NaCl เป็น 500 mM หากมี background ของไอออนสูง ห้ามใช้สาร chelators |
| Elution | 7.5 to 8.0 | 300 | 250 to 500 | แบบ step หรือ gradient; เก็บ fraction ขนาดเล็ก เปลี่ยนบัฟเฟอร์ทันทีหากงานวิเคราะห์ไวต่อ imidazole |
| Strip / Regeneration | 7.5 to 8.0 | 300 | 500 | เลือกใช้ 50 mM EDTA เพื่อกำจัดสารปนเปื้อนตกค้าง; เติม NiSO4 หรือ CoCl2 ก่อนนำกลับมาใช้ใหม่ |
| พารามิเตอร์ | Ni-NTA Resin | Co-Based Resin |
|---|---|---|
| Chelate ligand | NTA (nitrilotriacetic acid) | IDA (iminodiacetic acid) หรือ CMA |
| ไอออนโลหะ | Ni2+ | Co2+ |
| ความสามารถในการจับสัมพัทธ์ | สูงกว่า | ต่ำกว่า |
| ความบริสุทธิ์สัมพัทธ์ | ปานกลาง | สูงกว่า |
| การใช้งานที่เหมาะสมที่สุด | ตัวอย่างที่จำกัดปริมาณ, การคัดกรอง, การจับเบื้องต้น | การศึกษาโครงสร้าง, การวิเคราะห์ที่ไวต่อการรบกวน, การเตรียมงานความบริสุทธิ์สูง |
| Imidazole ใน wash buffer ทั่วไป | 20 to 40 mM | 20 to 40 mM |
| Imidazole ใน elution buffer ทั่วไป | 250 to 500 mM | 150 to 300 mM (มักต่ำกว่า) |
สรุป: การทำ His-tag protein purification โดยใช้ IMAC เป็นวิธีที่รวดเร็วและมีความจำเพาะในการเตรียมโปรตีนรีคอมบิแนนท์ที่ใช้งานได้ องค์ประกอบของบัฟเฟอร์เป็นตัวควบคุมความแข็งแรงในการจับและพฤติกรรมการชะออกโดยตรง ดังนั้นการตั้งค่าระดับ imidazole ในแต่ละขั้นตอนจึงเป็นขั้นตอนการเพิ่มประสิทธิภาพที่มีผลกระทบมากที่สุด ด้วยการใช้เรซิน บัฟเฟอร์ และแอนติบอดีตรวจสอบที่ถูกต้อง ห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่จะสามารถทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ได้ในระดับที่ต้องการภายในวันเดียว
คำถามที่พบบ่อย
ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค
ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express
เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ His-Tag Purification จาก Merck, TCI, MedChemExpress (MCE) และ Elabscience และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE
English 
Thai