SDS-PAGE คืออะไร? หลักการแยกโปรตีนด้วยไฟฟ้า

ทุกครั้งที่คุณเตรียมตัววิเคราะห์ตัวอย่างโปรตีน คุณมักจะต้องตัดสินใจในเรื่องเดิมๆ ว่า SDS-PAGE คืออะไรและเป็นวิธีที่เหมาะสมที่สุดในการตรวจสอบเบื้องต้นหรือไม่ ควรใช้เจลความเข้มข้นเท่าใดเพื่อให้แยกเป้าหมายของคุณได้ชัดเจน และแถบโปรตีนที่ปรากฏบอกอะไรเราได้บ้าง การตัดสินใจผิดพลาดอาจทำให้สิ้นเปลืองเจล ตัวอย่าง และเวลา บทความนี้จะเจาะลึกหลักการของ SDS-PAGE และแนะนำขั้นตอนการทำงานที่นำไปใช้ได้จริง ตั้งแต่การเลือกเจล บัฟเฟอร์ มาเกอร์ ไปจนถึงการย้อมสีอย่างมั่นใจ

SDS-PAGE คืออะไร? ทำความเข้าใจหลักการทำงานเบื้องต้น

หลักการของ SDS-PAGE นั้นตรงไปตรงมา โดย SDS-PAGE ย่อมาจาก Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis ซึ่งเป็นเทคนิคการแยกโปรตีนตามขนาดโมเลกุลเป็นหลัก สาร SDS เป็นสารซักฟอกที่มีประจุลบ (anionic detergent) ซึ่งจะทำหน้าที่แปลงสภาพโปรตีน (denature) และจับกับสายพอลิเปปไทด์ในอัตราส่วนประมาณ 1.4 กรัม ต่อโปรตีน 1 กรัม การเคลือบด้วย SDS อย่างสม่ำเสมอนี้จะบดบังประจุธรรมชาติของโปรตีนแต่ละชนิด ทำให้โปรตีนที่ถูกแปลงสภาพทั้งหมดมีอัตราส่วนประจุต่อมวลที่เป็นลบเท่าๆ กัน

เมื่อประจุธรรมชาติไม่มีผลต่อการเคลื่อนที่ ความเร็วในการเคลื่อนที่ผ่านเจลพอลิอะคริลาไมด์จึงแปรผันตามค่าลอการิทึมของน้ำหนักโมเลกุล โปรตีนขนาดเล็กจะเคลื่อนที่ผ่านช่องว่างของเจลได้รวดเร็วกว่า ในขณะที่โปรตีนขนาดใหญ่จะเคลื่อนที่ได้ช้ากว่า

ระบบ SDS-PAGE ส่วนใหญ่นิยมใช้ระบบแบบไม่ต่อเนื่อง (discontinuous system) โดยโปรตีนจะถูกทำให้เข้มข้นขึ้นใน Stacking gel ก่อนจะเข้าสู่ Resolving gel เพื่อแยกขนาด เทคนิคสองขั้นตอนนี้เองที่ทำให้ SDS-PAGE สามารถแยกแถบโปรตีนได้อย่างคมชัดและอ่านผลได้ง่าย

ขั้นตอนการทำงานของ SDS-PAGE

การเตรียมตัวอย่างและการแปลงสภาพ

เริ่มจากการผสมโปรตีนของคุณกับ Sample buffer ซึ่งมีส่วนประกอบของ SDS, กลีเซอรีน (เพื่อความหนาแน่นของตัวอย่าง), สีย้อมติดตาม เช่น Bromophenol blue และสารรีดิวซ์ (reducing agent) ได้แก่ DTT หรือ 2-mercaptoethanol สารรีดิวซ์นี้จะตัดพันธะไดซัลไฟด์ เพื่อให้โปรตีนคลายตัวออกอย่างสมบูรณ์

บ่มสารผสมที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 5 นาทีสำหรับโปรตีนที่ละลายน้ำได้ทั่วไป ส่วนโปรตีนที่เยื่อหุ้มเซลล์ซึ่งมักจะจับตัวเป็นก้อนได้ง่าย การใช้ 70°C จะปลอดภัยกว่า เมื่อได้รับความร้อน สายพอลิเปปไทด์จะถูกแปลงสภาพอย่างสมบูรณ์และถูกเคลือบด้วย SDS อย่างทั่วถึง

การ Stacking, การแยกขนาด และการตรวจวัด

เมื่อตัวอย่างเข้าสู่ Stacking gel ขอบเขตของไอออนที่เคลื่อนที่ระหว่างคลอไรด์และไกลซีนจะบีบอัดโปรตีนทั้งหมดให้รวมตัวกันเป็นแถบที่แคบมาก ผลของปรากฏการณ์นี้คือหัวใจสำคัญที่ทำให้หลักการ SDS-PAGE มีประสิทธิภาพ โปรตีนทุกชนิดจะเริ่มต้นจากจุดเดียวกันก่อนที่จะเริ่มกระบวนการแยกตามขนาด

เมื่อโปรตีนเคลื่อนเข้าสู่ Resolving gel ขอบเขตของไอออนจะสลายไป โปรตีนจะเดินทางผ่านช่องว่างของพอลิอะคริลาไมด์ด้วยความเร็วที่ขึ้นอยู่กับขนาดของมัน โปรตีนขนาดเล็กจะเดินทางได้เร็วกว่า ทำให้เกิดแถบที่ชัดเจนในตำแหน่งที่คาดการณ์ได้เมื่อเทียบกับ Molecular weight markers

หลังเสร็จสิ้นกระบวนการ จะมีการย้อมเจลเพื่อดูแถบโปรตีน จากนั้นคุณสามารถประมาณน้ำหนักโมเลกุลได้โดยเปรียบเทียบตำแหน่งของแถบกับ Protein ladder ที่ทราบขนาด สำหรับข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับหลักการแยกขนาดและตัวอย่างการใช้งาน ดูที่ การแยกโปรตีนตามขนาดโดยใช้เทคนิค SDS-Page

การเลือกความเข้มข้นของเจลตามขนาดเป้าหมาย

เปอร์เซ็นต์ของอะคริลาไมด์จะเป็นตัวควบคุมขนาดรูพรุน ตารางด้านล่างแสดงความสัมพันธ์ระหว่างความเข้มข้นของเจลและช่วงขนาดที่แยกได้ดี

สำหรับการรัน Mini gels ควรใช้แรงดันไฟฟ้า 100 ถึง 200 V และควบคุมอุณหภูมิของถังบรรจุเจลให้เย็นอยู่เสมอ การที่เจลร้อนเกินไปจะทำให้แถบโปรตีนผิดเพี้ยนและเกิดรูปแบบ "ยิ้ม" (smiling) ซึ่งขอบของแถบจะโค้งขึ้น

องค์ประกอบหลัก ระบบเจล และการตั้งค่า

น้ำยาและระบบเจล

คุณสามารถเลือกรูปแบบเจลได้สองแบบ คือ Pre-cast gels ซึ่งช่วยประหยัดเวลาและเพิ่มความแม่นยำในการรันซ้ำ เหมาะสำหรับงาน QC และห้องปฏิบัติการที่มีตัวอย่างปริมาณมาก ส่วน Hand-cast gels ช่วยให้คุณปรับเปอร์เซ็นต์อะคริลาไมด์หรือ Gradient ได้ตามต้องการ ซึ่งมีประโยชน์เมื่อต้องทำงานกับโปรตีนในช่วงขนาดพิเศษหรือปรับแต่งการทดลองใหม่

การเลือกระบบบัฟเฟอร์มีผลต่อคุณภาพของแถบ Tris-Glycine คือระบบ Laemmli แบบดั้งเดิมที่ยังคงได้รับความนิยมสูงสุด ข้อดีคือแถบจะคมชัด โดยเฉพาะเมื่อใช้เคมีของเจลและบัฟเฟอร์ที่เข้ากัน ส่วนระบบ Bis-Tris ที่ใช้คู่กับบัฟเฟอร์ MOPS หรือ MES จะให้ช่วงการแยกเชิงเส้นที่กว้างขึ้นและเพิ่มความละเอียดในงานบางประเภท

เมื่อไม่ทราบน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมาย ให้ใช้ Gradient gel ซึ่งสามารถแยกขนาดได้กว้างในการรันครั้งเดียว ช่วยลดค่าใช้จ่ายจากการต้องรันหลายเปอร์เซ็นต์ในระหว่างการจำแนกคุณลักษณะเบื้องต้น

Protein Electrophoresis Gels & Buffers จาก Merck และ TCI มีจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ครอบคลุมทั้งแบบ Pre-cast และชุดน้ำยา Laemmli สำหรับงาน Hand-cast

การเตรียมตัวอย่าง การโหลด และพารามิเตอร์การรัน

ใช้สารรีดิวซ์สดใหม่เสมอ เนื่องจาก DTT และ 2-mercaptoethanol อาจเสื่อมสภาพเมื่อเก็บไว้นานและไม่สามารถลดพันธะไดซัลไฟด์ได้สมบูรณ์ ส่งผลให้เกิดแถบโปรตีนขนาดใหญ่ที่ไม่คาดคิด ควรเตรียม Sample buffer ใหม่หรือแบ่งส่วนเก็บไว้โดยยังไม่เติมสารรีดิวซ์ แล้วจึงเติมก่อนใช้งาน

สำหรับโปรตีนที่เยื่อหุ้มเซลล์ ให้บ่มที่ 70°C นาน 10 นาทีแทนการต้ม เพราะการต้มอาจทำให้บริเวณไฮโดรโฟบิกเกาะกลุ่มและเกิดรอยเปื้อนขนาดใหญ่แทนที่จะเป็นแถบโปรตีนที่ชัดเจน

โหลดตัวอย่างอย่างสม่ำเสมอ เติมกลีเซอรีนลงในตัวอย่างที่ไม่มีสารนี้เพื่อให้ตัวอย่างจมลงในหลุมอย่างเรียบร้อย ล้างหลุมด้วยบัฟเฟอร์ก่อนโหลดเพื่อกำจัดเศษอะคริลาไมด์ที่ยังไม่เกิดพอลิเมอร์ซึ่งอาจรบกวนการ Stacking

ใช้ Pre-stained Protein Markers ในอย่างน้อยหนึ่งช่องเพื่อให้สามารถติดตามความคืบหน้าในการรันแบบ Real-time และอ้างอิงขนาดได้ทันทีหลังเสร็จสิ้น หากต้องการขนาดที่แม่นยำหลังย้อมสี ควรใช้ Unstained ladder ขนานไปด้วย

เริ่มรันที่ 60 ถึง 80 V ในขณะที่ตัวอย่างเคลื่อนผ่าน Stacking gel และเพิ่มเป็น 120 ถึง 180 V เมื่อตัวอย่างเข้าสู่ Resolving gel คอยติดตามอุณหภูมิ หากบัฟเฟอร์ในถังร้อนเกิน 50°C ให้ลดแรงดันไฟฟ้าหรือหยุดพักเพื่อให้ระบบเย็นลง

การย้อมสีและการถ่ายภาพ

Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB R-250) เป็นมาตรฐานสำหรับการทำ QC ทั่วไป โดยทั่วไปน้ำยาประกอบด้วย 0.25% CBB R-250 ในเมทานอล 50% และกรดอะซิติก 10% ตามด้วยขั้นตอนล้างสี (destaining) ด้วยเมทานอล 50% และกรดอะซิติก 10% ซึ่งให้ความไวเพียงพอสำหรับโปรตีนส่วนใหญ่ในงาน QC

สำหรับโปรตีนที่มีปริมาณน้อยมาก การย้อมด้วยเงิน (silver staining) สามารถตรวจพบได้ในระดับนาโนกรัม Fast Green FCF เป็นอีกทางเลือกหนึ่งที่วัดค่าได้ที่ 625 nm เหมาะสำหรับกรณีที่ต้องการผลวิเคราะห์เชิงปริมาณพร้อมการมองเห็น

การย้อมด้วยสารเรืองแสงให้ช่วงการวัด (dynamic range) ที่กว้างกว่า Coomassie หรือ Silver และรองรับการทำ Multiplex โดยไม่ต้องผ่านขั้นตอนล้างสีที่ยาวนาน

หากวางแผนต่อด้วย Mass Spectrometry ให้เลือกน้ำยาย้อมที่เข้ากันได้และปฏิบัติตามขั้นตอนของผู้ผลิตอย่างเคร่งครัด สาร SDS ที่ตกค้างหรือส่วนประกอบของสีย้อมอาจรบกวนการแตกตัวเป็นไอออนได้ Protein Electrophoresis Gel Stains จากทั้ง Merck และ TCI มีจำหน่ายที่ Chemical Express Thailand ครอบคลุมความต้องการตั้งแต่งานทั่วไปจนถึงงานวิเคราะห์ระดับสูง

ควรใช้ SDS-PAGE เมื่อใดและอยู่ในจุดไหนของกระบวนการทำงาน?

เมื่อใดควรเลือก SDS-PAGE

SDS-PAGE คือเทคนิคเบื้องต้นที่เหมาะสมที่สุดเมื่อต้องการประเมินความบริสุทธิ์ ประมาณน้ำหนักโมเลกุล ติดตามผลผลิตการแสดงออกของโปรตีน หรือติดตามโปรตีนระหว่างขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ ช่วยตอบคำถามสำคัญคือ "โปรตีนนี้มีขนาดถูกต้องและมีความบริสุทธิ์หรือไม่"

ควรเลือก SDS-PAGE แทน Native PAGE เมื่อต้องการข้อมูลขนาดโดยไม่ขึ้นกับรูปร่างหรือประจุธรรมชาติของโปรตีน ซึ่ง Native PAGE จะให้ข้อมูลที่ซับซ้อนกว่าเพราะรวมปัจจัยด้านขนาด รูปร่าง และประจุเข้าด้วยกัน

นอกจากนี้ SDS-PAGE ยังเป็นขั้นตอนหลักก่อนการทำ Western blotting โดยโปรตีนที่แยกตามขนาดจะถูกย้ายไปบนแผ่นเมมเบรนเพื่อตรวจหาเป้าหมายเฉพาะ การรัน SDS-PAGE ภายใต้เงื่อนไขเดียวกับการทำ Transfer จะช่วยประหยัดเวลาในการพัฒนาวิธีทดลอง

การประยุกต์ใช้งานในห้องปฏิบัติการไทย

ในงานวิจัยทางวิชาการ SDS-PAGE เป็นเครื่องมือมาตรฐานสำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีน ตรวจสอบการตัดแท็กที่ใช้ในการทำความสะอาดโปรตีน หรือตรวจหาการเปลี่ยนแปลงขนาดในโปรตีนกลายพันธุ์

ในห้องปฏิบัติการทางคลินิกและโรงพยาบาล SDS-PAGE ใช้ตรวจสอบความบริสุทธิ์ของน้ำยาที่เตรียมขึ้นเองและยืนยันว่าน้ำยาสำเร็จรูปไม่เสื่อมสภาพระหว่างเก็บรักษา การใช้งานทั้งหมดควรเป็นไปตามข้อกำหนดของสถาบันและระเบียบที่เกี่ยวข้องในประเทศไทย

ด้านวิทยาศาสตร์อาหารและเภสัชกรรม QC ใช้ SDS-PAGE เพื่อสนับสนุนการตรวจสอบความสม่ำเสมอของเนื้อหาโปรตีนในแต่ละรุ่นการผลิต ช่วยบันทึกหลักฐานสนับสนุนเอกสารกำกับดูแลและการตรวจสอบภายใน

ผลิตภัณฑ์ในกลุ่ม Electrophoresis & Western Blot ครอบคลุมตั้งแต่การรันเจลจนถึงการย้ายไปเมมเบรนและการตรวจจับด้วยแอนติบอดี สำรวจผลิตภัณฑ์ทั้งหมดได้ที่ Protein Electrophoresis & Western blotting เพื่อดูตัวเลือกของ Merck และ TCI ที่เหมาะสมกับขั้นตอนงานของคุณ

สรุป

หลักการของ SDS-PAGE ทำงานบนพื้นฐานเดียวคือ SDS จะปรับประจุให้เท่ากันทั่วโปรตีนทุกตัว ทำให้ขนาดกลายเป็นปัจจัยตัดสินระยะการเคลื่อนที่ของแต่ละแถบผ่านพอลิอะคริลาไมด์ภายใต้สนามไฟฟ้า

ในการปฏิบัติงานจริง คุณควรเลือกเปอร์เซ็นต์อะคริลาไมด์ให้ตรงกับขนาดเป้าหมาย จับคู่เคมีของเจลและบัฟเฟอร์ให้เหมาะสม ตั้งค่าแรงดันไฟฟ้าเพื่อควบคุมความร้อน และยืนยันผลด้วย Protein Markers และน้ำยาย้อมที่ถูกต้อง การตัดสินใจที่แม่นยำจะช่วยประหยัดเวลาและไม่ต้องรันงานซ้ำ

Chemical Express Thailand มีจำหน่ายเจล บัฟเฟอร์ Protein Markers และน้ำยาย้อมจาก Merck และ TCI ครอบคลุมทุกความต้องการ ติดต่อทีมงานของเราเพื่อเลือกผลิตภัณฑ์ที่เหมาะสมที่สุดกับโปรโตคอลของคุณ

คำถามที่พบบ่อย