วิธีใช้ Amicon Ultra เพื่อเข้มข้นโปรตีน: MWCO และการใช้งานอย่างถูกต้อง

การสูญเสียโปรตีนไปกับ ultrafiltration membrane, ค่ากิจกรรมของเอนไซม์ลดลงหลังปั่นเหวี่ยงนานเกินไป และการตกค้างของเกลือ คือสาเหตุหลักที่ทำให้กระบวนการ ultrafiltration ล้มเหลวก่อนถึงขั้นตอนการวิเคราะห์ ปัญหาเหล่านี้สามารถหลีกเลี่ยงได้หากเลือกขนาด MWCO ให้เหมาะสมกับโปรตีน ตั้งค่าแรงเหวี่ยง (g force) ที่ถูกต้อง และควบคุมรอบการปั่นแต่ละครั้ง คู่มือนี้จะแนะนำขั้นตอนการใช้ Amicon Ultra อย่างละเอียด ตั้งแต่การเลือกอุปกรณ์จนถึงการเก็บตัวอย่าง เพื่อให้คุณได้ผลผลิต (yield) สูงและได้สารละลาย (buffer) ที่สะอาดที่สุด

โปรโตคอลการเข้มข้นโปรตีนด้วย Amicon Ultra: ทำไมต้องใช้และใช้เมื่อไหร่

Ultrafiltration เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพสูงเมื่อต้องการลดปริมาตรตัวอย่างหรือเปลี่ยนสารละลายภายใต้สภาวะที่ไม่รุนแรง โดยปราศจากการตกตะกอน สารตัวทำละลายอินทรีย์ หรือสารทำให้โปรตีนเสียสภาพ (denaturants) เหมาะอย่างยิ่งสำหรับงานวิเคราะห์ต่างๆ ไม่ว่าจะเป็นการเตรียมตัวอย่างสำหรับ SDS-PAGE, การทดสอบ activity assays, การเตรียมสารตั้งต้นสำหรับ ELISA หรือการทำความสะอาดตัวอย่างก่อนนำไปวิเคราะห์ด้วย LC-MS หรือการติดฉลากแอนติบอดี (antibody labeling)

เมื่อเปรียบเทียบกับวิธี dialysis การใช้ centrifugal ultrafiltration สามารถลดปริมาตรและกำจัดเกลือได้เร็วกว่า โดยปกติจะใช้เวลาต่ำกว่า 1 ชั่วโมงสำหรับปริมาตร 0.1 ถึง 15 มล. วิธีนี้ช่วยลดความเค้นเชิงกลและเวลาที่โปรตีนต้องสัมผัสกับสภาวะภายนอก ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญสำหรับเอนไซม์ที่มีความเปราะบางหรือคอมเพล็กซ์โปรตีนที่เสียหายง่าย

วิธีนี้จะได้ผลดีที่สุดเมื่อโปรตีนเป้าหมายมีขนาดใหญ่กว่า MWCO ของ ultrafiltration membrane ที่เลือกใช้ และคุณต้องการกำจัดเกลือ สีย้อมขนาดเล็ก หรือสารติดฉลากที่ไม่ได้ทำปฏิกิริยาออกโดยไม่กระทบต่อโครงสร้างโปรตีน สำหรับภาพรวมในทางปฏิบัติของ การแยกโปรตีนด้วยตัวกรองแรงเหวี่ยง Merck Amicon Ultra รวมถึงการเปรียบเทียบรูปแบบและตัวอย่างการใช้งาน สามารถศึกษาได้จากข้อมูลอ้างอิงดังกล่าว หากคุณทราบข้อมูลโปรตีนของตนเองแล้ว สามารถใช้โปรโตคอลด้านล่างนี้ได้เลย

สิ่งที่ต้องเตรียม: อุปกรณ์, สารละลาย และเครื่องมือห้องปฏิบัติการ

อุปกรณ์กรองแบบแรงเหวี่ยง (Centrifugal filter devices)

คุณต้องใช้ อุปกรณ์ Amicon ultrafiltration ที่มีรูปแบบและค่า MWCO ที่เหมาะสมกับตัวอย่าง ซีรีส์ Amicon Ultra ครอบคลุมปริมาตร 3 รูปแบบ ได้แก่ Ultra-0.5 สำหรับปริมาตร 100 ถึง 500 µL, Ultra-4 สำหรับ 0.5 ถึง 4 มล. และ Ultra-15 สำหรับ 2 ถึง 15 มล. ค่า MWCO ทั่วไปจะมีขนาด 3, 10, 30 และ 100 kDa ให้เลือกเยื่อกรองที่สามารถกักเก็บโปรตีนเป้าหมายไว้ได้ในขณะที่ยอมให้สิ่งเจือปนไหลผ่านไป

เครื่องเหวี่ยงสาร (centrifuge) ของคุณต้องรองรับหลอดตัวอย่างและแรงเหวี่ยงที่กำหนด โดยทั่วไปหัวเหวี่ยงแบบ Fixed-angle จะให้ประสิทธิภาพการไหล (flux) ที่ดีกว่าแบบ swing-bucket สำหรับอุปกรณ์ปริมาตรน้อย ตรวจสอบความเข้ากันได้ของหัวเหวี่ยงก่อนเริ่มต้น

สารละลาย, รีเอเจนต์ และวัสดุสิ้นเปลือง

เตรียมสารละลายบัฟเฟอร์สำหรับแลกเปลี่ยน เช่น PBS, Tris-HCl, HEPES หรือ ammonium bicarbonate สำหรับการเตรียมตัวอย่างก่อนวิเคราะห์ด้วย MS โดยใช้บัฟเฟอร์ชนิดเดียวกันในการเตรียมเยื่อกรอง (pre-rinsing), เจือจางตัวอย่าง และทำ diafiltration เพื่อรักษาความคงตัวของเยื่อกรองตลอดทุกรอบการปั่น

เตรียมปิเปตที่ผ่านการสอบเทียบ (calibrated), ทิปแบบ low-binding และหลอด microtubes แบบ low-binding สำหรับเก็บสารละลายโปรตีน รวมถึงเตรียมหลอดถ่วงน้ำหนัก (balance tube) ให้มีน้ำหนักเท่ากันเพื่อใส่ในเครื่องเหวี่ยง สำหรับ อุปกรณ์เตรียมตัวอย่างโปรตีน รวมถึงสารยับยั้งโปรตีเอสและเครื่องมือสกัดโปรตีนที่ช่วยเสริมขั้นตอนการทำงานของคุณ คุณสามารถดูหมวดหมู่ผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องทั้งหมดได้

ในการทดสอบครั้งแรก ให้เติมโปรตีนมาตรฐานที่ไม่มีปฏิกิริยาปริมาณ 1 ถึง 5 µg ลงไป และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 280 nm ทั้งก่อนและหลังการปั่น เพื่อคำนวณอัตราการกู้คืน (recovery) จริง ซึ่งเร็วกว่าการมาแก้ไขปัญหาในภายหลังหากผลวิเคราะห์ล้มเหลว

การเลือกค่า MWCO และรูปแบบอุปกรณ์ที่เหมาะสม

การตัดสินใจที่สำคัญที่สุดในโปรโตคอลการเข้มข้นโปรตีนด้วย Amicon Ultra คือการเลือก MWCO เลือกเยื่อกรองที่มีขนาดเล็กกว่าน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมายประมาณ 2 ถึง 3 เท่า วิธีนี้จะช่วยกักเก็บโปรตีนได้ไม่ต่ำกว่า 90% ในขณะที่ปล่อยให้เกลือ โมเลกุลขนาดเล็ก และสารที่ไม่ได้ทำปฏิกิริยาไหลผ่านได้สะดวก

คำแนะนำการเลือกตามขนาดโปรตีน:

• 3 kDa: สำหรับเปปไทด์และโปรตีนขนาดเล็กในช่วง 5 ถึง 15 kDa
• 10 kDa: สำหรับเอนไซม์และโดเมนโปรตีนในช่วง 20 ถึง 70 kDa
• 30 kDa: สำหรับ IgG Fab fragments และโปรตีนขนาด 70 ถึง 150 kDa
• 100 kDa: สำหรับคอมเพล็กซ์โปรตีนขนาดใหญ่, แอนติบอดี และโปรตีนไวรัสที่มีขนาดเกิน 200 kDa

ปริมาตรของอุปกรณ์จะเป็นตัวกำหนดความจุในการรับตัวอย่าง ควรเติมตัวอย่างไม่เกินขีดระดับที่ระบุไว้ทุกครั้งเพื่อรักษาพื้นที่ว่างและป้องกันการล้น ตารางด้านล่างสรุปพารามิเตอร์การทำงานทั่วไปของแต่ละรูปแบบ

สำหรับการเปรียบเทียบเชิงลึกของ Amicon Ultra แต่ละรูปแบบและการประยุกต์ใช้งานในการแยกโปรตีน สามารถอ่านคู่มือ การแยกโปรตีนด้วยตัวกรองแรงเหวี่ยง Merck Amicon Ultra ซึ่งมีคำแนะนำเฉพาะสำหรับแต่ละรูปแบบโดยละเอียด

เตรียมอุปกรณ์และใส่ตัวอย่าง

1. ตรวจสอบ อุปกรณ์กรองก่อนใช้ สังเกตดูรอยร้าวที่ตัวกระบอก ยืนยันค่า MWCO ที่พิมพ์บนอุปกรณ์ และจดเลข Lot นัมเบอร์ ติดป้ายระบุหลอดเก็บตัวอย่างสำหรับทุกรอบการปั่น
2. ปรับสมดุลอุณหภูมิ ตัวอย่างให้เหมาะสมระหว่าง 4 ถึง 25 °C ขึ้นอยู่กับความคงตัวของโปรตีน สำหรับเอนไซม์และโปรตีนที่สลายตัวง่าย ควรเก็บที่ 4 °C ตลอดขั้นตอน
3. เตรียมเยื่อกรอง (Pre-rinse) โดยปิเปตบัฟเฟอร์ที่ใช้ให้ถึงขีดสูงสุด ปั่นเป็นเวลา 5 นาทีที่แรง 3,000 ถึง 4,000 x g (สำหรับ Ultra-4 หรือ Ultra-15) หรือปั่น 5 นาทีที่ 10,000 ถึง 12,000 x g (สำหรับ Ultra-0.5) จากนั้นเทส่วนที่ผ่านเยื่อกรองทิ้งให้หมด
4. ประเมินความหนืด ของตัวอย่าง หากสารละลายโปรตีนข้นเกินไป ให้เจือจางด้วยบัฟเฟอร์ 1-2 เท่าก่อนปั่นรอบแรก เพราะความหนืดสูงจะทำให้เยื่อกรองอุดตันอย่างรวดเร็วและลดประสิทธิภาพการไหลในรอบถัดไป
5. เติมตัวอย่าง โดยค่อยๆ ปิเปตลงที่ผนังด้านในของอุปกรณ์กรอง หลีกเลี่ยงการทำให้เกิดฟองอากาศ เพราะฟองอากาศจะไปกั้นพื้นที่เยื่อกรองและทำให้การไหลไม่สม่ำเสมอ
6. ถ่วงน้ำหนัก หัวเหวี่ยงด้วยหลอดที่มีน้ำหนักเท่ากัน การใช้เครื่องเหวี่ยงที่ไม่สมดุลขณะความเร็วสูงอาจทำให้ตัวกระบอกกรองแตกได้
7. บันทึก ปริมาตรเริ่มต้นให้แม่นยำ ซึ่งจำเป็นต่อการคำนวณอัตราส่วนการเข้มข้นและการตรวจสอบการกู้คืนเมื่อจบงาน

สำหรับการแลกเปลี่ยนบัฟเฟอร์ด้วยวิธี diafiltration ให้วางแผนจำนวนรอบก่อนเริ่ม โดยปกติการแลกเปลี่ยนบัฟเฟอร์ประมาณ 3 ถึง 5 เท่าของปริมาตรจะช่วยลดเกลือตกค้างให้ต่ำกว่า 5% คุณสามารถหาอุปกรณ์เสริมสำหรับบัฟเฟอร์และวัสดุห้องปฏิบัติการได้ผ่านผลิตภัณฑ์กลุ่ม การเตรียมตัวอย่างโปรตีน

การปั่นเหวี่ยง, การติดตามผล และการเก็บตัวอย่าง

1. ตั้งค่า ความเร็วรอบและอุณหภูมิเครื่องเหวี่ยง ใช้แรง 10,000 ถึง 14,000 x g ที่อุณหภูมิ 4 ถึง 25 °C สำหรับรุ่น Ultra-0.5 และใช้แรง 2,000 ถึง 4,000 x g ที่ 4 ถึง 25 °C สำหรับ Ultra-4 และ Ultra-15 โดยระบุความเร็วเป็น x g เสมอไม่ใช่ rpm เนื่องจากรัศมีของหัวเหวี่ยงในแต่ละเครื่องแตกต่างกัน
2. ปั่น รอบแรกเป็นเวลา 5 ถึง 10 นาที การปั่นสั้นๆ ในช่วงแรกจะช่วยให้ตรวจสอบประสิทธิภาพการไหลได้โดยไม่เสี่ยงต่อการเข้มข้นมากเกินไป ตรวจสอบปริมาตรที่ค้างอยู่ (retentate) หลังจบแต่ละรอบโดยดูจากขีดบอกระดับหรือใช้ปิเปตที่สอบเทียบแล้ว
3. ผสม สารที่ค้างอยู่เบาๆ หลังปั่นแต่ละรอบด้วยการปิเปตขึ้นลง 2-3 ครั้ง เพื่อสลายชั้นความเข้มข้นสะสมที่ผิวหน้าเยื่อกรอง ซึ่งเป็นชั้นของโปรตีนที่จะขัดขวางการไหลเมื่อการทำงานดำเนินไป
4. ปั่นต่อ เป็นรอบสั้นๆ จนถึงปริมาตรเป้าหมาย สำหรับการเข้มข้น 10 เท่าจาก 4 มล. เหลือ 0.4 มล. การปั่นที่ 4,000 x g สองรอบ รอบละ 10-15 นาทีมักเพียงพอ ให้ใช้การปั่นสั้นๆ 2-5 นาทีในช่วงท้ายเพื่อควบคุมปริมาตรอย่างละเอียด
5. เติม บัฟเฟอร์เป้าหมายเพื่อทำ diafiltration หลังจากเข้มข้นแต่ละขั้นตอน ให้เติมบัฟเฟอร์ใหม่ในปริมาตรที่เท่ากับสารที่ค้างอยู่ แล้วผสมให้เข้ากันและปั่นอีกครั้ง ทำซ้ำ 3-5 ครั้ง วิธีนี้ช่วยกำจัดสิ่งเจือปนที่เป็นโมเลกุลขนาดเล็ก เกลือ และสารติดฉลากได้มีประสิทธิภาพกว่าการปั่นรอบเดียว สำหรับงานที่ต้องอาศัยการแลกเปลี่ยนบัฟเฟอร์อย่างเข้มงวด Chemical Express Thailand มีเครื่องมือ workflow สำหรับชีววิทยาโปรตีน ที่รวมถึงอุปกรณ์ dialysis และ diafiltration สำหรับสเกลงานที่ใหญ่ขึ้น
6. เก็บ สารโปรตีนเข้มข้น โดยการพลิกหัวอุปกรณ์ลงในหลอดเก็บตัวอย่างสะอาด แล้วปั่นที่ประมาณ 1,000 x g เป็นเวลา 2 นาที
7. ล้าง เยื่อกรองด้วยบัฟเฟอร์ 50 ถึง 200 µL วนรอบเบาๆ และนำส่วนที่ล้างได้ไปรวมกับโปรตีนที่เก็บไว้ วิธีนี้มักช่วยกู้คืนโปรตีนที่เกาะติดอยู่ได้เพิ่มอีก 5 ถึง 15%
8. วัด ค่า A280 หรือทำการวิเคราะห์โปรตีนในสารที่เก็บได้เปรียบเทียบกับค่าเริ่มต้นเพื่อยืนยันการกู้คืนก่อนนำไปวิเคราะห์ในขั้นตอนถัดไป

เคล็ดลับและข้อควรระวังเพื่อการกู้คืนโปรตีนสูง

การสูญเสียโปรตีนส่วนใหญ่ในการทำ ultrafiltration เกิดจากข้อผิดพลาดที่ป้องกันได้ เช่น การเตรียมเยื่อกรองไม่ทั่วถึง, แรงเหวี่ยงสูงเกินไป, ลืมผสมตัวอย่าง, และการละเลยอุณหภูมิ เคล็ดลับด้านล่างนี้จะช่วยแก้ไขปัญหาที่พบได้บ่อยในการปฏิบัติงานห้องปฏิบัติการ

สำหรับโปรตีนที่เหนียวมาก ให้พิจารณาปรับความแรงไอออน (ionic strength) เพิ่มขึ้นเล็กน้อย (เช่น เติม NaCl 150 ถึง 300 mM) เพื่อลดแรงดึงดูดทางไฟฟ้าสถิตกับเยื่อกรอง แต่ต้องตรวจสอบก่อนว่าสารเติมแต่งนั้นจะไม่รบกวนการวิเคราะห์ขั้นตอนถัดไป

จัดเก็บอุปกรณ์ Amicon Ultra ที่ยังไม่ใช้ในที่ปิดสนิทและที่อุณหภูมิห้อง หลีกเลี่ยงการสัมผัสสารตัวทำละลายอินทรีย์ หรือสภาวะที่เป็นกรด/ด่างรุนแรงเกินช่วง pH ที่เยื่อกรองรองรับได้ ทิ้งอุปกรณ์ทันทีหากกระบอกกรองมีรอยแตกหรือชำรุด

คู่มือการแก้ไขปัญหา

ตารางด้านล่างครอบคลุม 6 ปัญหาที่พบบ่อยที่สุดในการใช้ Amicon Ultra พร้อมวิธีการแก้ไขที่ตรงจุด

สรุป: การรันโปรโตคอลการเข้มข้นโปรตีนด้วย Amicon Ultra ให้เชื่อถือได้

ทุกขั้นตอนของเวิร์กโฟลว์นี้ยึดหลักการเดียวคือการควบคุมสิ่งที่เยื่อกรองต้องเจอ การเลือก MWCO ให้เหมาะกับขนาดโปรตีน การเตรียมสภาพเยื่อกรองก่อนใช้งาน และการปั่นรอบสั้นๆ พร้อมผสมระหว่างรอบ คือปัจจัยตัดสินความสำเร็จของผลผลิตและความบริสุทธิ์

ใช้ตารางคำแนะนำ MWCO และพารามิเตอร์ของอุปกรณ์เพื่อตั้งแรงเหวี่ยง เวลา และเลือกขนาดให้เหมาะสมก่อนเริ่ม รันรอบ diafiltration อย่างเป็นระบบเมื่อต้องการเปลี่ยนบัฟเฟอร์ เก็บตัวอย่างอย่างระมัดระวัง วัดค่า A280 และตรวจสอบผลให้แน่ใจก่อนนำไปวิเคราะห์ต่อ

ตัวกรองแรงเหวี่ยง Amicon Ultra ซึ่งมีจำหน่ายที่ Chemical Express Thailand ภายใต้กลุ่มผลิตภัณฑ์ Merck Amicon ครอบคลุมการเข้มข้นโปรตีนและการทำ diafiltration ตั้งแต่การเตรียมตัวอย่าง 100 µL จนถึงการเตรียมระดับ 15 มล. เลือกรูปแบบที่เหมาะกับปริมาตรงานของคุณและปรับตามการสเกลงานในอนาคต

คำถามที่พบบ่อย