สูตรโครมาโทกราฟีที่ต้องรู้: Resolution, Efficiency, Plate Number
เมื่อพีกซ้อนทับกัน, การตรวจสอบระบบ (system suitability) ไม่ผ่าน และคุณต้องการคำอธิบายที่รวดเร็วและน่าเชื่อถือว่าเหตุใด resolution ถึงลดลงหลังจากการเปลี่ยนคอลัมน์ ทฤษฎีทั่วไปอาจไม่ช่วยคุณในสถานการณ์นั้น คู่มือฉบับนี้ได้รวบรวมสูตรโครมาโทกราฟีที่แม่นยำสำหรับ resolution, efficiency และ plate number รวมถึงหลักการวัดที่ถูกต้องและขั้นตอนเชิงปฏิบัติเพื่อคำนวณและปรับปรุงประสิทธิภาพในการรัน LC หรือ GC ของคุณ
คู่มือหลักเกี่ยวกับสูตรโครมาโทกราฟี: Resolution, Efficiency และ Plate Number
สูตรโครมาโทกราฟีสำหรับ resolution, efficiency และ plate number คือตัวบ่งชี้ 3 ค่าที่มีความสัมพันธ์กันเพื่ออธิบายประสิทธิภาพการแยก สาร (separation) โดย Resolution (Rs) เป็นตัวบ่งชี้ระดับการแยกออกจากกันของพีกสองพีกที่อยู่ติดกัน, Plate number (N) คือค่าที่ใช้วัดประสิทธิภาพของคอลัมน์ และ Plate height (H) คือค่าประสิทธิภาพที่ปรับให้เป็นค่ามาตรฐานตามความยาวของคอลัมน์
ค่าทั้ง 3 นี้คือรากฐานสำคัญของการตรวจสอบ system suitability ใน LC หรือ GC หากคุณคำนวณค่าเหล่านี้ได้อย่างถูกต้อง การแก้ไขปัญหา (troubleshooting) จะกลายเป็นเรื่องที่เป็นระบบมากกว่าการเดาสุ่ม
สมการ Resolution
หลักการวัดความกว้าง (width) ที่ยอมรับได้มี 2 แบบ ให้เลือกใช้แบบใดแบบหนึ่งและใช้ให้สม่ำเสมอตลอดรายงานของคุณ
Baseline width convention:
Rs = 2 × (tR2 − tR1) ÷ (w1 + w2)
Half-height width convention:
Rs = 1.18 × (tR2 − tR1) ÷ (w½1 + w½2)
สมการ Efficiency
Baseline width: N = 16 × (tR ÷ wb)²
Half-height width: N = 5.54 × (tR ÷ w0.5)²
Plate height: H = L ÷ N โดยที่ L คือความยาวคอลัมน์ที่มีหน่วยเดียวกับ H
ค่าจำนวนเพลทต่อเมตร (N/L) ช่วยให้คุณเปรียบเทียบคอลัมน์ที่มีความยาวต่างกันได้
| สูตร | ตัวแปร | หน่วย | หลักการวัด |
|---|---|---|---|
| Rs = 2(tR2 − tR1) ÷ (w1 + w2) | tR: retention time; w: baseline width | เวลา (นาที หรือ วินาที); Rs ไม่มีหน่วย | Baseline width |
| Rs = 1.18(tR2 − tR1) ÷ (w½1 + w½2) | tR: retention time; w½: half-height width | เวลา (นาที หรือ วินาที); Rs ไม่มีหน่วย | Half-height width |
| N = 16 × (tR ÷ wb)² | tR: retention time; wb: baseline width | เวลาที่สอดคล้องกัน; N ไม่มีหน่วย | Baseline width |
| N = 5.54 × (tR ÷ w0.5)² | tR: retention time; w0.5: half-height width | เวลาที่สอดคล้องกัน; N ไม่มีหน่วย | Half-height width |
| H = L ÷ N | L: ความยาวคอลัมน์; N: plate number | mm หรือ cm (ให้ตรงกับ L) | ทั้งสองแบบ |
Baseline width เทียบกับ Half-height width: เลือกใช้วิธีไหน
- จำเป็นสำหรับ pharmacopoeial system suitability test หลายรายการ
- มีความไวต่อการเกิด peak tailing และ fronting มากกว่า
- วัดจากโครมาโทแกรมที่พิมพ์ออกมาด้วยมือได้ยาก
- ใช้เมื่อ SOP หรือวิธีวิเคราะห์ของคุณระบุให้ใช้ตามมาตรฐาน USP หรือ EP
- วัดได้ง่ายกว่าและได้รับผลกระทบน้อยกว่าจากสัญญาณรบกวนของ baseline
- เป็นที่นิยมเมื่อพีกมีอาการ tailing เล็กน้อยและ baseline มีสัญญาณรบกวน
- นิยมใช้ในการพัฒนาวิธีวิเคราะห์ (method development) ของ GC และรายงานวิจัย
- ใช้เมื่อซอฟต์แวร์ CDS ของคุณรายงานค่านี้เป็นค่าเริ่มต้น
หากคุณกำลังทำงานกับ TLC โปรดทราบว่าค่า Rf ที่ใช้ในงานนั้นเป็นตัวบ่งชี้คนละตัวกัน ดูข้อมูลเพิ่มเติมได้ที่คู่มือการคำนวณค่า Rf ในโครมาโทกราฟี สำหรับสูตรและขั้นตอนที่ถูกต้อง
วิธีการวัด Retention time และ Peak width เพื่อคำนวณ Rs และ N อย่างถูกต้อง
การจะได้ค่า Rs และ N ที่แม่นยำ เริ่มต้นจากการวัดพีกที่ถูกต้อง โดยระบบ Chromatography Data System (CDS) ของคุณจะรายงานค่า tR ณ จุดสูงสุดของพีก ให้บันทึกค่า tR1 และ tR2 สำหรับพีกสองพีกที่คุณกำลังประเมิน
สำหรับ Baseline width (wb) ซอฟต์แวร์จะลากเส้นสัมผัสจากจุด inflection point ของพีกลงมาถึง baseline และอ่านค่าความกว้างที่จุดตัด ส่วน Half-height width (w0.5) ซอฟต์แวร์จะวัดความกว้างพีก ณ จุดความสูง 50% ของพีก
ตัวอย่างการคำนวณ
สมมติว่าพีกสองพีกชะออกที่ tR1 = 5.20 นาที และ tR2 = 5.85 นาที โดยมี baseline width คือ w1 = 0.40 นาที และ w2 = 0.44 นาที
Rs = 2 × (5.85 − 5.20) ÷ (0.40 + 0.44) = 2 × 0.65 ÷ 0.84 = 1.55
สำหรับพีกที่สอง คำนวณค่า N โดยใช้สมการ baseline:
N = 16 × (5.85 ÷ 0.44)² = 16 × (13.30)² = 16 × 176.9 = 2,830 plates
หาก Half-height width ของพีกเดียวกันคือ w0.5 = 0.26 นาที จะได้:
N = 5.54 × (5.85 ÷ 0.26)² = 5.54 × (22.50)² = 5.54 × 506.3 = 2,805 plates
ผลลัพธ์ทั้งสองค่าใกล้เคียงกันแต่ไม่เหมือนกัน ซึ่งเป็นเรื่องปกติ ให้เลือกรายงานเพียงค่าเดียวและระบุว่าเลือกใช้วิธีใด
บทบาทของ Void time และการตั้งค่า Integration
Void time (t0) คือเวลาที่สารที่ไม่ถูกหน่วงเวลา (unretained compound) ชะออกมา แม้ไม่ได้ใช้ในสูตร Rs หรือ N โดยตรง แต่จำเป็นสำหรับคำนวณ Retention factor (k) = (tR − t0) ÷ t0 ทั้งนี้ การตั้งค่า integration ให้คงที่ในการฉีดตัวอย่างแต่ละครั้งเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้ค่าความกว้างพีกมีความแม่นยำ
| คำศัพท์ | คำนิยาม | วิธีอ่านค่าจาก CDS |
|---|---|---|
| tR (retention time) | เวลาจากการฉีดสารจนถึงยอดพีก | ตารางพีก, คอลัมน์ retention time |
| wb (baseline width) | ความกว้างที่ฐานพีกจากการลากเส้นสัมผัส | ตารางพีก, คอลัมน์ width at base |
| w0.5 (half-height width) | ความกว้างพีกที่ 50% ของความสูงยอดพีก | ตารางพีก, คอลัมน์ width at half-height |
| t0 (void time) | เวลาที่สาร marker ที่ไม่ถูกหน่วงชะออกมา | กำหนดด้วยมือหรือการรันแยก |
| k (retention factor) | (tR − t0) ÷ t0 | คอลัมน์คำนวณหรือกรอกข้อมูลด้วยมือ |
เคล็ดลับสำหรับการวัดพีกที่เชื่อถือได้
- ปรับสภาพคอลัมน์ให้สมบูรณ์ (equilibrate) ก่อนการฉีดสารครั้งแรก
- ตรวจสอบการ calibrate แกนเวลาในระบบ CDS ก่อนเริ่มเก็บข้อมูล
- บันทึกค่า t0 โดยใช้สารที่ไม่ถูกหน่วง เช่น uracil ใน HPLC หรือ methane ใน GC
- กำหนดค่า integrator threshold, width และ sensitivity ให้เหมือนกันทุกการรัน
- ส่งออกตารางพีกทั้งหมดและใช้ Spreadsheet คำนวณค่า Rs และ N เพื่อตรวจสอบย้อนกลับ (audit trails)
- รายงานค่าด้วยเลขนัยสำคัญ 3 ตำแหน่ง เว้นแต่ข้อมูลความแม่นยำของคุณจะระบุเป็นอย่างอื่น
สำหรับข้อมูลพื้นฐานเกี่ยวกับวิธีการจัดการพารามิเตอร์เหล่านี้ในระบบ LC สามารถอ่านเปรียบเทียบได้ที่ Liquid Chromatography vs HPLC: ความแตกต่าง หลักการ และการประยุกต์ใช้งาน
ปัจจัยที่มีผลต่อ Resolution และ Efficiency ในทางปฏิบัติ
Resolution จะเพิ่มขึ้นเมื่อประสิทธิภาพ (efficiency) เพิ่มขึ้น, ความสามารถในการเลือกแยกสาร (selectivity) ดีขึ้น หรือมีการเพิ่ม retention ที่เหมาะสม รูปแบบที่พบบ่อยในการพัฒนาวิธีวิเคราะห์ทำให้ความสัมพันธ์นี้ชัดเจนขึ้น:
Rs ∝ √N × [(α − 1) ÷ α] × [k ÷ (1 + k)]
พจน์ทั้ง 3 นี้คือตัวแทนของ Efficiency, Selectivity และ Retention ตามลำดับ เนื่องจาก Rs แปรผันตามค่ารากที่สองของ N การเพิ่มความยาวคอลัมน์เป็นสองเท่าจะเพิ่มค่า Rs ได้เพียงประมาณ 41% เท่านั้น แต่การเปลี่ยน Selectivity (พจน์กลาง) มักจะให้ผลลัพธ์ที่เพิ่มขึ้นมากกว่ามากโดยไม่ต้องเพิ่มความดันหรือเวลาในการวิเคราะห์
พฤติกรรม Van Deemter และผลกระทบในทางปฏิบัติ
สมการ Van Deemter อธิบายถึงการเปลี่ยนแปลงของค่าความสูงเพลท (H) ตามความเร็วของเฟสเคลื่อนที่ (mobile phase velocity): H = A + B/u + C × u ในช่วงอัตราการไหลต่ำ Longitudinal diffusion (พจน์ B) จะมีผลหลักทำให้ค่า H เพิ่มขึ้น และในช่วงอัตราการไหลสูง Mass transfer resistance (พจน์ C) จะมีผลหลักทำให้ค่า H เพิ่มขึ้นอีกครั้ง ดังนั้นจึงมีความเร็วที่เหมาะสม (optimum velocity) ที่ทำให้ค่า H ต่ำที่สุดและ N สูงที่สุด
ขนาดอนุภาคที่เล็กลงจะช่วยลดพจน์ A และ C ทำให้ค่า H ต่ำลงในขณะที่ใช้อัตราการไหลที่สูงขึ้น นี่คือหลักการที่อยู่เบื้องหลังอนุภาคขนาดเล็กกว่า 2 ไมครอนที่ใช้ใน UHPLC แต่ข้อแลกเปลี่ยนที่ตามมาคือ Backpressure ที่สูงขึ้น
ตัวแปรของวิธีการวิเคราะห์เทียบกับตัวแปรของระบบ
ตัวแปรต่างๆ อยู่คนละประเภท ตัวแปรของวิธีการวิเคราะห์ (Method variables) เป็นส่วนที่คุณควบคุมได้โดยตรงระหว่างการพัฒนา ในขณะที่ตัวแปรของระบบ (System variables) ต้องอาศัยการดูแลจากตัวเครื่องมือเอง ซึ่งมักจะถูกมองข้ามว่าเป็นสาเหตุของประสิทธิภาพที่ลดลง
ตัวแปรของวิธีการวิเคราะห์ที่ควรปรับปรุง:
- เคมีของคอลัมน์และขนาด (Stationary phase, ความยาว, เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน)
- องค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่และความแรงของตัวทำละลาย
- ค่า pH และความแรงของไอออนในบัฟเฟอร์
- อุณหภูมิคอลัมน์
- อัตราการไหล (เพื่อเข้าใกล้จุด optimum ของ Van Deemter)
ตัวแปรของระบบที่ควรควบคุม:
- ปริมาตรภายนอกคอลัมน์ (tubing, fittings, เซลล์ตรวจวัด)
- อัตราการตอบสนองของเครื่องตรวจวัด (Detector) และความถี่ในการเก็บข้อมูล
- เส้นผ่านศูนย์กลางภายในของท่อและความยาวของจุดเชื่อมต่อ
- ปริมาตรการฉีดเทียบกับปริมาตรของพีก
- อัตราการเก็บข้อมูล (Data sampling rate)
การสนับสนุนเวิร์กโฟลว์การพัฒนาและ QC ที่เชื่อถือได้ ต้องอาศัยการจัดหาวัสดุสิ้นเปลืองที่มีมาตรฐาน ทั้งตัวทำละลาย คอลัมน์ ขวดตัวอย่าง และบัฟเฟอร์ โดยกลุ่มผลิตภัณฑ์ Analytical Chromatography ของ Merck ครอบคลุมคอลัมน์ HPLC, คอลัมน์ GC, บัฟเฟอร์ HPLC, ตัวทำละลาย, ขวดวิเคราะห์ และ chromatography standards ทำให้คุณได้แหล่งจัดซื้อเดียวสำหรับวัสดุสิ้นเปลืองที่มีผลโดยตรงต่อค่า N และ Rs ในการรันงานประจำวันของคุณ
ไม่แน่ใจว่าเทคนิคโครมาโทกราฟีแบบไหนเหมาะกับตัวอย่างของคุณ? ลองอ่านเรื่อง เมื่อใดที่ควรใช้โครมาโทกราฟีและวิธีการเลือกเทคนิคที่เหมาะสม ก่อนตัดสินใจเลือกรูปแบบคอลัมน์หรือวิธีการวิเคราะห์
สรุป
ใช้สูตร Baseline width (Rs ใช้ตัวคูณ 2, N ใช้ตัวคูณ 16) เมื่อ SOP หรือวิธีวิเคราะห์ตาม pharmacopoeia ระบุไว้ ใช้สูตร Half-height (Rs ใช้ตัวคูณ 1.18, N ใช้ตัวคูณ 5.54) เมื่อสัญญาณรบกวนของ baseline ทำให้การใช้ tangent integration ไม่น่าเชื่อถือ ไม่ว่าคุณจะเลือกใช้วิธีใด ให้ใช้ให้เหมือนกันทั้ง Rs และ N ในรายงานเดียวกัน และเน้นการปรับปรุง Selectivity ก่อนที่จะพยายามเพิ่มจำนวนเพลทเพื่อพัฒนาค่า Resolution อย่างรวดเร็ว
| ตัวบ่งชี้ | สูตร | หลักการวัดความกว้าง | หน่วยสำคัญ |
|---|---|---|---|
| Resolution (Rs) | 2(tR2 − tR1) ÷ (w1 + w2) | Baseline | ไม่มีหน่วย |
| Resolution (Rs) | 1.18(tR2 − tR1) ÷ (w½1 + w½2) | Half-height | ไม่มีหน่วย |
| Plate number (N) | 16 × (tR ÷ wb)² | Baseline | ไม่มีหน่วย |
| Plate number (N) | 5.54 × (tR ÷ w0.5)² | Half-height | ไม่มีหน่วย |
| Plate height (H) | L ÷ N | แบบใดก็ได้ | mm หรือ cm |
| Plates per meter | N ÷ L (L ในหน่วยเมตร) | แบบใดก็ได้ | plates m⁻¹ |
| Retention factor (k) | (tR − t0) ÷ t0 | n/a | ไม่มีหน่วย |
คำถามที่พบบ่อย
ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค
ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express
เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ General Chromatography จาก Merck และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE
Thai 
English