Glycine ในงานชีวเคมีและ SDS-PAGE: คุณสมบัติและการใช้งาน

แถบโปรตีนที่เบี้ยว กระจายตัว หรือวิ่งไม่สม่ำเสมอ มักมีสาเหตุมาจากปัจจัยที่ถูกมองข้าม นั่นคือเกรดของ glycine ที่คุณเลือกใช้และความระมัดระวังในการเตรียมบัฟเฟอร์ Tris-glycine การเลือก glycine ชีวเคมี (glycine biochemical grade SDS-PAGE) ให้เหมาะสมกับงานเป็นสิ่งสำคัญสำหรับนักจัดซื้อ ส่วนนักวิจัยในห้องปฏิบัติการต้องการผลลัพธ์ที่คาดเดาได้ในการทำ stacking และการ transfer โปรตีนในทุกครั้ง คู่มือนี้จะครอบคลุมถึงพื้นฐานทางเคมี การเลือกเกรด glycine วิธีเตรียมบัฟเฟอร์ การแก้ไขปัญหา และตัวเลือกสินค้าที่มีจำหน่ายในประเทศไทย

Glycine ชีวเคมีสำหรับ SDS-PAGE คืออะไรและมีการใช้งานอย่างไร?

Glycine ในงานชีวเคมีสำหรับ SDS-PAGE หมายถึง glycine ความบริสุทธิ์สูงที่ทำหน้าที่เป็น trailing ion ในระบบการแยกโปรตีนแบบ Laemmli Tris-glycine-SDS เกรดชีวเคมีบ่งบอกถึงระดับสิ่งเจือปนที่เป็นไอออนและดูดกลืนแสง UV ต่ำ ทำให้เหมาะสำหรับการทำอิเล็กโตรโฟรีซิส (electrophoresis) และงานวิเคราะห์ทางชีวเคมีที่ต้องการความแม่นยำสูง ความบริสุทธิ์นี้ส่งผลโดยตรงต่อความคมชัดของแถบโปรตีนและสัญญาณรบกวนพื้นหลังในการตรวจวัดในขั้นตอนถัดไป

ในการปฏิบัติงาน glycine จะถูกใช้ในบัฟเฟอร์หลักสองชนิด ได้แก่ 1x running buffer มาตรฐานที่มี 25 mM Tris, 192 mM glycine และ 0.1% SDS ส่วน Towbin transfer buffer ใช้ส่วนประกอบ Tris-glycine พื้นฐานเช่นเดียวกันแต่เพิ่ม methanol 10 ถึง 20% เพื่อช่วยในการย้ายโปรตีนไปยังแผ่นเมมเบรน PVDF หรือ nitrocellulose

Glycine ทำหน้าที่ควบคุมแนวหน้าของไอออน (ion front) โดยเปลี่ยนสถานะระหว่าง zwitterionic และ anionic ตามการเปลี่ยนแปลงของค่า pH ในเจล ใน stacking gel ที่ pH 6.8 glycine จะอยู่ในสถานะ zwitterionic เป็นส่วนใหญ่และเคลื่อนที่ช้า ในขณะที่ running buffer ที่ pH 8.3 มันจะเปลี่ยนเป็น anionic มากขึ้นและเคลื่อนที่เร็วขึ้น ช่วยผลักดันการแยกโปรตีน การระบุว่าเป็น glycine เกรดชีวเคมีในใบสั่งซื้อจะช่วยหลีกเลี่ยงความแปรปรวนจากเกรดทั่วไป ซึ่งมักเป็นสาเหตุของปัญหาแถบโปรตีนไม่คมชัด

Glycine ช่วยให้แถบโปรตีนคมชัดในระบบ Laemmli ได้อย่างไร

ระบบ Laemmli อาศัยการแข่งขันระหว่างไอออนสองชนิดเพื่อกำหนดอัตราเร็วในการเคลื่อนที่ Chloride จากบัฟเฟอร์ในเจลทำหน้าที่เป็นไอออนนำ (leading ion) ที่รวดเร็ว ส่วน glycine ที่ pH 6.8 ใน stacking gel จะแทบไม่มีประจุสุทธิและเคลื่อนที่ช้าจึงเป็น trailing ion โปรตีนที่มีความเร็วในการเคลื่อนที่ปานกลางจะถูกบีบอัดให้เป็นแถบที่คมและบางระหว่างเขตไอออนทั้งสองนี้ก่อนเข้าสู่ resolving gel สำหรับรายละเอียดทางเทคนิคเชิงลึก สามารถดูได้ที่บทความของเราเรื่อง การแยกโปรตีนตามขนาดโดยใช้ SDS-PAGE

เมื่อตัวอย่างเข้าสู่ resolving gel ที่ pH 8.8 glycine จะได้รับประจุลบเพิ่มขึ้น ทำให้แนวหน้าของไอออนขยายตัวและโปรตีนเริ่มแยกออกจากกันตามขนาดภายในเมทริกซ์ของ polyacrylamide การเปลี่ยนจากสภาวะ stacking ที่แน่นหนาไปสู่การแยกตัวที่ชัดเจนนี้เองที่ทำให้เจลแบบ Laemmli แสดงแถบโปรตีนที่คมชัดตั้งแต่ด้านบนจนถึงด้านล่าง

การทำงานที่ถูกต้องของ glycine จะแสดงสัญญาณให้เห็นชัดเจน 3 ประการ คือ ขอบเขตการ stacking ที่คมชัดในช่วงต้นของการวิ่ง แถบโปรตีนที่สมมาตรในทุกช่อง และระยะการเคลื่อนที่ที่คาดเดาได้ซึ่งตรงกับ molecular weight marker ในการรันเจลซ้ำทุกครั้ง

คุณสมบัติทางเทคนิคและความเข้มข้นที่ใช้

ตารางด้านล่างสรุปคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีที่สำคัญของ glycine รวมถึงความเข้มข้นมาตรฐานที่ใช้ในขั้นตอน SDS-PAGE และ Western transfer

เมื่อตรวจสอบใบรับรองผลการวิเคราะห์ (COA) ให้ดูที่ค่าการดูดกลืนแสง UV ที่ 260 nm และ 280 nm, ปริมาณ chloride, sulfate, โลหะหนัก และการสูญเสียน้ำหนักจากการอบแห้ง ค่าพารามิเตอร์เหล่านี้ส่งผลโดยตรงต่อความสม่ำเสมอของแนวหน้าไอออนและสัญญาณพื้นหลังในการตรวจวัดด้วยฟลูออเรสเซนซ์หรือ blot ทั้ง Merck และ TCI ต่างมีผลิตภัณฑ์ glycine ที่มีค่า COA เหมาะสมสำหรับใช้ในบัฟเฟอร์อิเล็กโตรโฟรีซิส

เมื่อใดที่ควรเลือกใช้ glycine เกรดชีวเคมีสำหรับ SDS-PAGE เทียบกับเกรดอื่น

Glycine ทุกชนิดไม่ได้มีมาตรฐานเดียวกัน การเลือกเกรดมีผลต่อคุณภาพของเจลมากกว่าที่หลายห้องปฏิบัติการตระหนักจนกว่าจะพบปัญหาเจลเสียหายจากการใช้ glycine เกรดต่ำ ตารางเปรียบเทียบด้านล่างช่วยให้คุณเลือกเกรดที่เหมาะสมตามการใช้งาน

ในการออกใบสั่งซื้อ ให้ระบุพารามิเตอร์เหล่านี้เพื่อปกป้องขั้นตอนการทำงานมาตรฐาน (SOP) ของคุณ: ความบริสุทธิ์จากการไทเทรตหรือ HPLC, ขีดจำกัดของ chloride และ sulfate, ปริมาณโลหะหนัก, ค่าการดูดกลืน UV ที่ 260 nm และ 280 nm, ระดับ endotoxin (หากจำเป็นสำหรับงานเอนไซม์ที่มีความไวสูง) และยืนยันความสม่ำเสมอระหว่าง lot

สำหรับการเตรียมตัวอย่าง Proteomics และ Metabolomics การเลือกสารเติมแต่งในบัฟเฟอร์มีความสำคัญมากกว่าแค่ตัวเจล glycine ความบริสุทธิ์สูงมักใช้ในขั้นตอน quenching ใช้งานคู่กับสารมาตรฐานกรดอะมิโนที่ผ่านการรับรองเพื่อการวัดปริมาณที่แม่นยำ ดูข้อมูลเพิ่มเติมได้ที่คู่มือของเราเรื่อง Merck Amino Acid Reference Materials for GC/MS and LC/MS analysis เพื่อเป็นทางเลือกที่ส่งเสริมขั้นตอนการวิเคราะห์ของคุณ

ในสภาพอากาศชื้นของประเทศไทย ขนาดบรรจุภัณฑ์ก็เป็นเรื่องสำคัญ ระบุปริมาณบรรจุที่สอดคล้องกับอัตราการใช้งานรายเดือน บรรจุภัณฑ์ขนาดใหญ่ที่เปิดใช้งานบ่อยครั้งจะดูดความชื้น ทำให้เกิดการจับตัวเป็นก้อนและเปลี่ยนค่าการนำไฟฟ้าของบัฟเฟอร์ที่เตรียมขึ้นได้

การใช้งานในห้องปฏิบัติการ: บัฟเฟอร์, SDS-PAGE และการย้ายโปรตีน

การเตรียม Running Buffer

เตรียมสารละลาย 10x stock ที่ประกอบด้วย 250 mM Tris base, 1.92 M glycine และ 1% SDS จากนั้นเจือจางเป็น 1x สำหรับการรันเจลแต่ละครั้ง หลังเจือจาง ให้ยืนยันค่า pH 8.3 และวัดค่าการนำไฟฟ้า สารละลายที่ใสไม่มีตะกอนบ่งบอกถึงการละลายของ SDS และความเข้มข้นของ glycine ที่ถูกต้อง

Sample Buffer

Glycine ไม่ใช่ส่วนประกอบใน 2x Laemmli sample buffer มาตรฐาน ซึ่งประกอบด้วย Tris-HCl pH 6.8, SDS, glycerol, bromophenol blue และสารรีดิวซ์ ตรวจสอบสูตรของคุณก่อนเตรียม การเผลอเติม glycine ลงใน sample buffer จะเปลี่ยนค่าความแรงไอออนและอาจส่งผลกระทบต่อการแยกโปรตีนในโซน stacking

การย้ายโปรตีน (Towbin Buffer)

Towbin transfer buffer ใช้ 25 mM Tris, 192 mM glycine และ 10 ถึง 20% methanol ความเข้มข้นของ methanol มีผลต่อประสิทธิภาพการย้ายและปริมาณโปรตีนที่ติดอยู่บนเมมเบรน ลดความเข้มข้น methanol ลงเหลือ 0 ถึง 5% สำหรับโปรตีนที่มีน้ำหนักมากกว่า 150 kDa เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการย้าย แต่อย่าลืมว่า methanol ที่ต่ำกว่าอาจลดการจับตัวของโปรตีนในเมมเบรนสำหรับเป้าหมายที่มีขนาดเล็กและมีสมบัติไม่ชอบน้ำ

สำหรับงานวิเคราะห์ที่ต้องการวัดปริมาณ glycine หรือกรดอะมิโนอื่นๆ ด้วย LC-MS หรือ GC-MS การใช้สารมาตรฐานภายในที่มีการติดฉลากไอโซโทปเสถียร (stable isotope labeled) เป็นวิธีที่เชื่อถือได้มากที่สุด บทความของเราเรื่อง Stable Isotope Labeled Amino Acid Mixes from Sigma-Aldrich ครอบคลุมถึงสารมาตรฐานที่เหมาะสมกับการใช้งานเหล่านี้

การทำ Quenching และ Blocking

Glycine ที่ความเข้มข้น 100 mM สามารถ quench กลุ่ม aldehyde ที่ตกค้างหลังจากการทำ paraformaldehyde fixation ในงานชีววิทยาเซลล์ได้ และที่ความเข้มข้นต่ำยังช่วยลดพื้นหลังในงาน immunoassay บางรูปแบบ การใช้งานเหล่านี้ต่างจากการทำอิเล็กโตรโฟรีซิส ดังนั้นควรตรวจสอบความต้องการด้านความบริสุทธิ์ให้ตรงกับประเภทงานนั้นๆ

สรุปและรายการตรวจสอบการจัดซื้อ

Glycine ควบคุมพลวัตของแนวหน้าไอออนในระบบ Laemmli SDS-PAGE ความสม่ำเสมอของค่า pH, การนำไฟฟ้า และความบริสุทธิ์ในทุก lot ช่วยรักษาการทำ stacking ที่คมชัดและการเคลื่อนที่ของโปรตีนที่คาดเดาได้ การเลือกเกรดที่มีการรับรองระดับสิ่งเจือปนต่ำ พร้อมกับการเตรียมบัฟเฟอร์ที่เข้มข้นและ pH ที่ถูกต้อง จะช่วยให้คุณได้ผลลัพธ์ที่ทำซ้ำได้ทุกครั้ง

ใช้รายการตรวจสอบด้านล่างเมื่อสั่งซื้อหรือตรวจสอบ COA จากซัพพลายเออร์:

• ระบุ "glycine biochemical grade SDS-PAGE" ในใบสั่งซื้อเพื่อป้องกันการสลับเกรด
• ตรวจสอบค่าขีดจำกัดการดูดกลืน UV ที่ 260 nm และ 280 nm ใน COA ก่อนรับ lot สินค้า
• ยืนยันว่าขีดจำกัดของ chloride, sulfate และโลหะหนักตรงตามเกณฑ์ SOP ของคุณ
• เลือกขนาดบรรจุที่สอดคล้องกับอัตราการใช้งานรายเดือนเพื่อหลีกเลี่ยงการดูดความชื้น
• เก็บในที่แห้งและปิดสนิทที่อุณหภูมิ 15 ถึง 25°C หลีกเลี่ยงการเก็บใกล้แหล่งความชื้น
• จดบันทึกหมายเลข lot คู่กับผลการรันเจลแต่ละครั้งเพื่อตรวจสอบย้อนกลับหากเกิดรูปแบบแถบที่เปลี่ยนไป

คำถามที่พบบ่อย