คำนวณค่า Rf ใน Chromatography อย่างไร? สูตรและขั้นตอนที่ถูกต้อง

ทีมของคุณรันแผ่น TLC แล้วต้องมาถกเถียงกันนานสิบนาทีว่าจะวัดระยะจากจุดไหน และทำไมค่า Rf ของเมื่อวานถึงไม่เท่ากับของวันนี้ ปัญหาความเห็นไม่ตรงกันนี้ทำให้การรับรองวิธีการล่าช้าและสิ้นเปลืองการรันโดยใช่เหตุ คู่มือนี้จะให้สูตรที่แม่นยำสำหรับการคำนวณค่า Rf chromatography, ลำดับขั้นตอนที่มีคำอธิบายประกอบ, ตัวอย่างการคำนวณ และการควบคุมที่ช่วยให้ผลลัพธ์สามารถทำซ้ำได้

สูตรและขั้นตอนการคำนวณค่า Rf chromatography

วิธีคำนวณค่า Rf chromatography เริ่มต้นด้วยอัตราส่วนง่ายๆ คือ Rf เท่ากับระยะทางที่สารเคลื่อนที่ได้ หารด้วยระยะทางที่ตัวทำละลายเคลื่อนที่ได้ (Solvent front) โดยวัดจากเส้น baseline ที่ขีดด้วยดินสอเดียวกัน ให้วัดไปจนถึงจุดศูนย์กลางของสปอต (Spot) ผลลัพธ์ที่ได้จะไม่มีหน่วยและมีค่าอยู่ระหว่าง 0 ถึง 1 เสมอ

ปฏิบัติตามลำดับขั้นตอนเหล่านี้ในทุกการรัน:

1. ขีดเส้น baseline ด้วยดินสอเบาๆ ที่ความสูง 10 มม. จากขอบล่างของแผ่น TLC
2. หยดสารตัวอย่างที่ baseline ด้วย capillary spotter ให้สปอตมีขนาดเล็กและเข้มข้น
3. นำแผ่นไปแช่ใน Chamber ที่ผ่านการปรับสภาวะ (pre-equilibrated) จนกระทั่งตัวทำละลายเคลื่อนที่ถึงจุดประมาณ 10 มม. จากขอบบน
4. นำแผ่นออกมาแล้วทำเครื่องหมาย Solvent front ด้วยดินสอทันทีก่อนที่ตัวทำละลายจะระเหยไป
5. ทำให้แผ่นแห้ง จากนั้นตรวจสอบสปอตภายใต้แสง UV หรือใช้รีเอเจนต์ในการทำสี
6. วัดระยะจาก baseline ไปยังจุดศูนย์กลางของแต่ละสปอต และจาก baseline ไปยังตำแหน่ง Solvent front
7. ใช้สูตร: Rf = ระยะทางที่สปอตเคลื่อนที่ได้ / ระยะทางที่ตัวทำละลายเคลื่อนที่ได้

ตัวอย่างสั้นๆ: หากจุดศูนย์กลางของสปอตอยู่ที่ 32 มม. จาก baseline และ Solvent front อยู่ที่ 80 มม. จาก baseline ค่า Rf = 32 ÷ 80 = 0.40 จงใช้สูตรเดียวกันนี้ทุกครั้ง โดยใช้หน่วยวัดที่สม่ำเสมอทั้งสองค่าจากเส้นอ้างอิงเดียวกัน

การทำงานของค่า Rf และวิธีการแปลผล

ค่า Rf สะท้อนถึงความสมดุลระหว่างแรงดึงดูดของสารวิเคราะห์ (analyte) กับ Stationary phase และความสามารถในการละลายใน Mobile phase หากสารทำปฏิกิริยากับ Stationary phase ได้แรงขึ้น ค่า Rf จะต่ำลง และหากสารละลายมีความเป็นขั้วสูงขึ้นหรือ eluent แรงขึ้น ค่า Rf จะสูงขึ้น

ช่วงเป้าหมายที่ใช้ได้จริงคือ Rf 0.2 ถึง 0.8 สปอตที่ใกล้ 0 จะเกาะกลุ่มอยู่ที่ baseline และเสี่ยงต่อการซ้อนทับกับสารอื่นที่มีค่า Rf ต่ำ ส่วนสปอตที่ใกล้ 1 มักจะเคลื่อนที่ไปพร้อมกับ Solvent front ซึ่งทำให้สังเกตได้ยาก

ความบริสุทธิ์ของตัวทำละลายส่งผลโดยตรงต่อความสมดุลนี้ การปนเปื้อนของน้ำหรือสิ่งเจือปนที่ไม่ระเหยจะเปลี่ยนความเป็นขั้วของ Mobile phase ทำให้ค่า Rf ไม่คงที่ในการรันแต่ละครั้ง SupraSolv® Solvents จาก Merck ถูกจัดเตรียมมาเพื่อลดสิ่งเจือปนเหล่านี้ ซึ่งช่วยให้ความเป็นขั้วของ Mobile phase มีความเสถียรและข้อมูล Rf มีความสม่ำเสมอในแต่ละล็อต

ส่วนประกอบสำคัญและการตั้งค่าสำหรับการวัดค่า Rf บนแผ่น TLC ที่แม่นยำ

ก่อนจะเริ่มวัดระยะทาง วัสดุและการตั้งค่าจะต้องมีความสม่ำเสมอ เตรียมอุปกรณ์ต่อไปนี้ให้พร้อม:

• แผ่น TLC (แผ่นรองเป็นแก้ว อะลูมิเนียม หรือพลาสติก)
• Chamber สำหรับพัฒนาผลที่มีฝาปิดสนิทและกระดาษซับสำหรับสร้างสภาวะอิ่มตัว
• Mobile phase ที่เตรียมใหม่จากตัวทำละลายความบริสุทธิ์สูง
• Capillary spotter หรือ micro-syringe
• ดินสอ (ห้ามใช้ปากกา) และไม้บรรทัดหรือดิจิตอลคาลิปเปอร์
• เครื่องมือตรวจสอบ: โคมไฟ UV ที่ 254 nm หรือ 365 nm หรือรีเอเจนต์ทำสี

การเลือก Stationary phase มีความสำคัญไม่แพ้การเลือกตัวทำละลาย TLC Silica Gel 60 G Plates with Gypsum by Merck ใช้ตัวประสานยิปซัมที่ยึดชั้นซิลิกาไว้อย่างแน่นหนาระหว่างการพัฒนาผล ทำให้เกิดแรงดึงดูดจากหลอดเลือดฝอย (capillary action) ที่สม่ำเสมอในทุกแผ่น ความสม่ำเสมอนี้หมายความว่าหากค่า Rf เปลี่ยนไปในการรันแต่ละครั้ง ก็น่าจะเกิดจากการเปลี่ยนแปลงของเคมีจริงๆ มากกว่าความผิดปกติของแผ่น

สำหรับทีมงานที่ถามว่าควรคำนวณค่า Rf chromatography อย่างไรให้เชื่อถือได้ การควบคุมขั้นตอน 3 ประการต่อไปนี้มีผลมากกว่าการปรับสูตรใดๆ คือ ให้ปรับสภาวะ Chamber ด้วยกระดาษกรองที่แช่ใน Mobile phase อย่างน้อย 10 นาที หยดสารให้เล็กและแคบเพื่อหลีกเลี่ยงอาการหางลาก (tailing) และรักษาปริมาณสารตัวอย่างให้ต่ำเพื่อให้สปอตยังคงความกะทัดรัดหลังการรัน

ตัวอย่างการคำนวณ เคล็ดลับการวัด และข้อผิดพลาดทั่วไป

ตารางด้านล่างแสดงการแยกสารสององค์ประกอบเพื่อให้เห็นว่าการอ่านค่า Rf ทำได้โดยตรงจากการวัดด้วยไม้บรรทัด

สารประกอบ B เคลื่อนที่ไปพร้อมกับสารอ้างอิง ซึ่งยืนยันเอกลักษณ์เบื้องต้นในระบบนี้ ช่องว่างระหว่างค่า Rf ของ A และ B (0.35) ทำให้เห็นการแยกตัวที่ชัดเจน

ข้อผิดพลาดทั่วไปส่งผลต่อ Rf มากกว่าที่คิด การหยดสารมากเกินไปทำให้เกิดโซนที่ใหญ่และฟุ้งกระจายจนระบุจุดศูนย์กลางได้ยาก การที่ Solvent front โค้งงอซึ่งเกิดจากระดับตัวทำละลายไม่เท่ากันหรือแผ่นเอียง ทำให้ได้ระยะทางต่างกันในแต่ละจุด การวัดไปที่ขอบสปอตแทนที่จะเป็นศูนย์กลางจะเพิ่มค่าความคลาดเคลื่อนที่เป็นระบบ หากใช้ตัวทำละลายที่ปนเปื้อนหรือดูดความชื้นจะเปลี่ยนความเป็นขั้วและค่าการคงอยู่ (retention) อย่างคาดเดาไม่ได้ นี่เป็นเหตุผลที่ควรใช้ตัวทำละลายเกรด Chromatography เช่น SupraSolv® แทนการใช้ขวดเกรดรีเอเจนต์ทั่วไปที่เปิดทิ้งไว้บนโต๊ะ

ข้อสรุปสำคัญและวิธีการใช้ค่า Rf ในห้องปฏิบัติการ

ค่า Rf เป็นค่าเฉพาะระบบ ขึ้นอยู่กับแผ่นที่ใช้ องค์ประกอบของตัวทำละลาย อุณหภูมิ และความอิ่มตัวของ Chamber ในขณะนั้น ควรบันทึกสภาวะทั้งหมดควบคู่ไปกับค่าที่ได้ และเปรียบเทียบค่า Rf ภายในระบบเดียวกันหรือกับสารอ้างอิงที่รันบนแผ่นเดียวกันเท่านั้น

ใช้ค่า Rf สำหรับการตรวจสอบเอกลักษณ์อย่างรวดเร็ว การคัดกรองตัวทำละลายระหว่างการพัฒนาระเบียบวิธี และการติดตามส่วนแยกจากคอลัมน์ด้วย TLC ห้ามเปรียบเทียบค่า Rf ระหว่างแผ่นหรือ Mobile phase ต่างชนิดกัน และห้ามใช้ Rf ในการวิเคราะห์เชิงปริมาณหากยังไม่ได้ผ่านการตรวจสอบความถูกต้องของความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณและสัญญาณภายใต้สภาวะที่กำหนด

สำหรับงานประจำ ให้ควบคุมสารที่สนใจให้อยู่ในช่วง Rf 0.2 ถึง 0.6 จัดเก็บภาพถ่ายของแผ่น TLC พร้อมสเกลอ้างอิงและบันทึกสภาวะการรันทั้งหมด บันทึกเหล่านี้จะเปลี่ยนค่าตัวเลข Rf ให้กลายเป็นข้อมูลที่ตรวจสอบย้อนกลับและถ่ายทอดได้

คำถามที่พบบ่อย