Size Exclusion Chromatography (SEC): แยกโมเลกุลตามขนาดสำหรับ Protein Analysis

การวิเคราะห์ปริมาณ aggregates ในกลุ่มตัวอย่างแอนติบอดีของคุณไม่ควรใช้เวลาครึ่งค่อนวัน หรือต้องใช้วิธีที่ทำให้ผลลัพธ์บิดเบือน หลายห้องปฏิบัติการเสียเวลาไปกับการถกเถียงเรื่องการเลือกคอลัมน์ หรือแก้ไขปัญหาพีกมีหาง (peak tailing) ก่อนที่จะเริ่มการแยกสารจริง บทความนี้จะมอบแผนที่การใช้งานจริงที่ช่วยให้คุณเข้าใจว่า size exclusion chromatography สำหรับ protein analysis ทำงานอย่างไร วิธีเลือกวัสดุบรรจุคอลัมน์ (media) และบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม พร้อมวิธีเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ทำซ้ำได้ (reproducible) บนระบบ HPLC ปัจจุบันของคุณ

size exclusion chromatography สำหรับ protein analysis คืออะไร?

size exclusion chromatography สำหรับ protein analysis เป็นเทคนิคที่ใช้แยกโปรตีนตามขนาดของโมเลกุล (hydrodynamic size) ขณะเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ที่บรรจุด้วยวัสดุที่มีรูพรุน (porous media) โดยโมเลกุลขนาดใหญ่จะไม่สามารถเข้าสู่รูพรุนได้ จึงถูกชะออกมาเป็นลำดับแรก ส่วนโมเลกุลขนาดเล็กจะแพร่เข้าไปในโครงข่ายของรูพรุน ทำให้ใช้เวลาอยู่ในเฟสอยู่กับที่ (stationary phase) นานกว่า จึงถูกชะออกมาในภายหลัง

วิธีนี้ดำเนินการภายใต้สภาวะไอโซเครติก (isocratic) ในบัฟเฟอร์ที่มีความเข้ากันได้ทางชีวภาพ (biocompatible) โดยไม่จำเป็นต้องใช้การไล่ระดับความเข้มข้น (gradient) ทำให้เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการวิเคราะห์โปรไฟล์ของ aggregates ในโมโนโคลนอลแอนติบอดี, การตรวจสอบสถานะการรวมตัว (oligomerization state) ของเอนไซม์ และขั้นตอนการกำจัดเกลือหรือเปลี่ยนบัฟเฟอร์อย่างรวดเร็ว

ตัวอย่างการใช้งานจริง: IgG monomer ที่ประมาณ 150 kDa สามารถแยกออกจาก dimer และ aggregates ที่มีขนาดใหญ่กว่าได้อย่างชัดเจนโดยใช้เครื่องตรวจวัด UV ที่ความยาวคลื่น 280 nm การแยกนี้ไม่จำเป็นต้องอาศัยอันตรกิริยาทางประจุหรือ affinity ligand แต่อาศัยเพียงขนาดรูพรุนที่ถูกต้องและบัฟเฟอร์ที่มีความเสถียรเท่านั้น

size exclusion chromatography แยกโปรตีนตามขนาดได้อย่างไร

หลักการขับเคลื่อนหลักคือการกระจายตัว (partitioning) โดยโปรตีนแต่ละโมเลกุลจะเกิดสมดุลระหว่างเฟสเคลื่อนที่ (mobile phase) ที่ไหลผ่านช่องว่างระหว่างอนุภาค กับบัฟเฟอร์ที่อยู่ภายในรูพรุน ซึ่งการกระจายตัวนี้ขึ้นอยู่กับรัศมีไฮโดรไดนามิก (hydrodynamic radius) ไม่ใช่น้ำหนักโมเลกุลโดยตรง โปรตีนที่มีการเติมน้ำตาล (glycosylated) สูงจะมีพฤติกรรมเสมือนมีขนาดใหญ่กว่าโปรตีนแบบ globular ที่มีมวลเท่ากัน

จุดอ้างอิงสามประการกำหนดพื้นที่การแยกสาร ได้แก่ ปริมาตรช่องว่าง (void volume, V_o) ซึ่งเป็นปริมาตรที่สารขนาดใหญ่มากจะถูกชะออกมา ปริมาตรการแทรกซึมทั้งหมด (total permeation volume, V_t) คือจุดที่สารขนาดเล็กที่สุดถูกชะออกมา และสัมประสิทธิ์การกระจายตัว (partition coefficient, K_d) ที่แสดงตำแหน่งของโปรตีนแต่ละชนิด โดย K_d ใกล้ 0 หมายถึงการถูกกันออกเกือบสมบูรณ์ และ K_d ใกล้ 1 หมายถึงการแทรกซึมเข้าสู่รูพรุนได้เกือบทั้งหมด

ประสิทธิภาพของคอลัมน์ขึ้นอยู่กับตัวแปรทางกายภาพหลายประการ การใช้คอลัมน์ที่ยาวขึ้นและขนาดอนุภาคที่เล็กลงช่วยเพิ่มความสามารถในการแยกสาร (resolution) ระหว่างชนิดที่มีขนาดใกล้เคียงกัน แต่จะเพิ่ม backpressure ในขณะที่อัตราการไหลที่ช้าลงจะเพิ่มเวลาในการเข้าสู่สมดุลภายในรูพรุนและช่วยให้พีกคมชัดขึ้น แม้ว่าจะต้องแลกกับเวลาการรันที่นานขึ้น อุณหภูมิส่งผลต่อทั้งความเสถียรของโปรตีนและความหนืดของบัฟเฟอร์ ดังนั้นการวิเคราะห์ SEC ส่วนใหญ่จึงรันที่อุณหภูมิห้องหรืออุณหภูมิควบคุมที่ 25 °C

SEC ไม่ได้อาศัยอันตรกิริยาทางประจุ ซึ่งเป็นเหตุผลที่ทำให้เทคนิคนี้เป็นส่วนเสริมของเทคนิคการแยกตามประจุ หากโจทย์ของคุณเกี่ยวข้องกับ charge variants หรือการจับกับไอออนอย่างจำเพาะเจาะจง การแยกด้วยการแลกเปลี่ยนไอออน (Ion Exchange Chromatography) จะมีบทบาทที่ต่างออกไป อ่านรายละเอียดเพิ่มเติมในหัวข้อ อ่านเพิ่มเติม: Ion Exchange Chromatography: หลักการการแยกโปรตีนและเปปไทด์

คำเตือนเรื่อง secondary interaction: SEC อาศัยการคัดขนาดเพียงอย่างเดียว หากความเข้มข้นของไอออนต่ำเกินไป หรือค่า pH ใกล้เคียงกับจุดไอโซอิเล็กทริก (isoelectric point) ของโปรตีน แรงดึงดูดทางไฟฟ้าสถิตกับ matrix ของคอลัมน์จะทำให้พีกมีหางหรือ retention เปลี่ยนไป อันตรกิริยาแบบไม่ชอบน้ำ (hydrophobic interactions) ก็สามารถสร้างปัญหาคล้ายกันได้ ควรปรับความเข้มข้นของเกลือและ pH ของบัฟเฟอร์ก่อนจะสรุปว่าการเลื่อนของพีกเกิดจากความแตกต่างของขนาดจริง

การเลือกคอลัมน์ Sorbent และเฟสเคลื่อนที่สำหรับ SEC ที่เชื่อถือได้

การเลือกคอลัมน์เริ่มต้นจากการจับคู่ช่วงการแยก (fractionation range) ของเรซินให้ตรงกับขนาดโมเลกุลที่ต้องการแยก หากโปรตีนเป้าหมายของคุณอยู่ใกล้จุดสูงสุดหรือต่ำสุดของช่วงการแยก ประสิทธิภาพในการแยก aggregates หรือ fragments จะลดลง ควรเลือกให้โปรตีนหลักอยู่ใกล้จุดกึ่งกลางของช่วง K_d

สำหรับ SEC ของโปรตีนในสารละลายน้ำ เฟสเคลื่อนที่มาตรฐานมักใช้ 20 ถึง 100 mM ฟอสเฟตหรือบัฟเฟอร์ Tris โดยเติม 100 ถึง 300 mM NaCl ที่ค่า pH ที่รักษาความเสถียรของโปรตีน เกลือที่สูงจะช่วยยับยั้ง secondary interactions หลีกเลี่ยงการเติมตัวทำละลายอินทรีย์ยกเว้นในกรณีที่ทำงานกับโปรตีนเมมเบรนที่ชอบน้ำมัน เนื่องจากตัวทำละลายอินทรีย์อาจทำให้โปรตีนคลายตัวหรือเปลี่ยนสภาพเรซิน

สำหรับข้อมูลพื้นฐานว่าการตั้งค่าระบบ HPLC ส่งผลต่อประสิทธิภาพอย่างไรในภาพรวม สามารถอ่านบทความ Liquid Chromatography (LC) เทียบกับ HPLC: ความแตกต่าง หลักการ และการประยุกต์ใช้ ซึ่งครอบคลุมถึงการตั้งค่าระบบที่เกี่ยวข้องกับ workflow ของ SEC

การเลือกคอลัมน์และขนาดรูพรุน

ขนาดรูพรุนควบคุมช่วงขนาดของโมเลกุลที่ถูกแยก เลือกโดยพิจารณาจากน้ำหนักโมเลกุลของสารที่มีขนาดเล็กที่สุดเทียบกับ aggregates หรือคอมเพล็กซ์ที่มีขนาดใหญ่ที่สุด ตารางด้านล่างสรุปช่วงการแยกทั่วไปสำหรับโปรตีนแบบ globular

ประเภทขนาดรูพรุน	ช่วง MW (โดยประมาณ)	การประยุกต์ใช้งานทั่วไป
รูพรุนขนาดเล็ก (เช่น 100 A)	1 to 15 kDa	เปปไทด์, โปรตีนขนาดเล็ก, การกำจัดเกลือ
รูพรุนขนาดกลาง (เช่น 200 to 300 A)	10 to 150 kDa	ไซโตไกน์, เอนไซม์, Fab fragments
รูพรุนขนาดใหญ่ (เช่น 500 A)	100 to 500 kDa	IgG monomers, dimers และ aggregates
รูพรุนขนาดใหญ่มาก (เช่น 1000 A+)	500 kDa to several MDa	VLP, AAV, คอมเพล็กซ์โปรตีนขนาดใหญ่

LiChroprep® Sorbent จาก Merck มอบทางเลือก silica-based ที่ชอบน้ำซึ่งเหมาะสำหรับการแยกแบบ SEC และงานสเกลเตรียมสาร (preparative) ความสม่ำเสมอระหว่าง lot ช่วยลดความแปรปรวนในการย้ายวิธีวิเคราะห์ (method transfer) และสามารถขยายสเกลจากการวิเคราะห์ไปสู่ระดับเตรียมสารได้โดยไม่ต้องปรับแต่งใหม่ทั้งหมด ทำให้เป็นทางเลือกที่ใช้งานได้จริงสำหรับห้องปฏิบัติการที่ทำทั้ง QC และการพัฒนากระบวนการด้วยโปรโตคอลเดียวกัน

การเลือกประเภท Sorbent สำหรับ SEC

Silica-based SEC

ทนต่อแรงดันสูง เหมาะกับระบบ HPLC
ความเสถียรเชิงกลสูงที่อัตราการไหลเร็ว
ใช้งานได้ดีในช่วง pH 2 ถึง 8 (ตรวจสอบสเปกเรซิน)
อาจต้องปรับสภาพพื้นผิวเพื่อลด secondary interactions

Polymer-based SEC

ช่วง pH ที่กว้างขึ้น (ปกติ 1 ถึง 14)
ลดการจับแบบไม่จำเพาะ (nonspecific binding) สำหรับโมเลกุลที่มีประจุ
โดยทั่วไปทนแรงดันได้ต่ำกว่าซิลิกา
ใช้บ่อยในการแยกสารชีวภาพและการพัฒนาระบบวิเคราะห์

Agarose-based SEC

ความเข้ากันได้ทางชีวภาพสูง อ่อนโยนต่อโปรตีนที่เปราะบาง
มี nonspecific binding ต่ำภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา
เหมาะสำหรับงาน preparative และสเกลการผลิต
ทนอัตราการไหลได้ต่ำ ไม่เหมาะกับ HPLC แรงดันสูง

เคล็ดลับสำหรับการตั้งค่าวิธีวิเคราะห์ SEC

กรองบัฟเฟอร์ทั้งหมดผ่านเมมเบรน 0.22 micron และไล่อากาศ (degas) ก่อนใช้งาน เพื่อป้องกันฟองอากาศในคอลัมน์
รันปรับสมดุลคอลัมน์อย่างน้อย 2 ถึง 3 เท่าของปริมาตรคอลัมน์ก่อนฉีดตัวอย่าง
ควบคุมปริมาณการฉีด (injection volume) ให้อยู่ระหว่าง 0.5 ถึง 2 เปอร์เซ็นต์ของปริมาตรคอลัมน์ทั้งหมดสำหรับการวิเคราะห์
ใช้ guard column เพื่อยืดอายุการใช้งานคอลัมน์วิเคราะห์ โดยเฉพาะเมื่อใช้กับตัวอย่างโปรตีนที่ยังไม่ผ่านการทำบริสุทธิ์
Calibration ด้วยมาตรฐานโปรตีนที่ครอบคลุมช่วงขนาดเป้าหมายของคุณ และรันมาตรฐานภายใต้สภาวะเดียวกันกับตัวอย่าง
ตรวจสอบ backpressure ของระบบในการรันแต่ละครั้ง หากแรงดันพื้นฐานสูงขึ้นมักเป็นสัญญาณของการอุดตันหรือการเกิดช่องว่างในคอลัมน์

การประยุกต์ใช้งานและเวลาที่ควรเลือกใช้ SEC ในกระบวนการทำงานด้านโปรตีน

การหาปริมาณ Aggregate

SEC เป็นวิธีมาตรฐานสำหรับการแยก monomer, dimer และสารที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงในแอนติบอดีและโปรตีนรีคอมบิแนนท์ การตรวจวัด UV ที่ 280 nm ช่วยให้หาปริมาณพื้นที่พีกได้โดยตรง การใช้เครื่องตรวจวัด Multi-angle Light Scattering (MALS) ร่วมด้วยจะช่วยให้ทราบมวลโมเลกุลที่แท้จริงโดยไม่จำเป็นต้องอาศัยการ Calibration ซึ่งมีค่ามากสำหรับตัวอย่างที่มีความหลากหลายหรือมี glycosylation

การวิเคราะห์สถานะ Oligomerization และคอมเพล็กซ์

เอนไซม์ คอมเพล็กซ์โปรตีนเมมเบรน และนิวคลีโอโปรตีนสามารถเปลี่ยนสถานะ oligomer ขึ้นอยู่กับสภาวะของบัฟเฟอร์ SEC ที่รันภายใต้สภาวะบัฟเฟอร์ที่ใกล้เคียงสภาวะธรรมชาติ (native) จะช่วยแยกสถานะเหล่านั้นได้ในการรันแบบ isocratic เพียงครั้งเดียว อุปกรณ์ HPLC ที่เป็น bio-inert (ทางเดินสารเป็นไทเทเนียมหรือ PEEK) ช่วยลดการเกิด oxidation จากโลหะในระหว่างการวัดที่ละเอียดอ่อนนี้

การกำจัดเกลือและการเปลี่ยนบัฟเฟอร์

คอลัมน์ SEC ขนาดสั้นที่มี exclusion limit ต่ำจะช่วยแยกโมเลกุลขนาดเล็ก เกลือ และรีเอเจนต์ออกจากโปรตีนได้ในไม่กี่นาที โปรตีนจะถูกชะออกมาใน void volume ในขณะที่สารปนเปื้อนขนาดเล็กจะแทรกซึมผ่านรูพรุนและถูกชะออกมาภายหลัง ทำให้เหมาะสำหรับการเตรียมตัวอย่างก่อนการวิเคราะห์ในขั้นตอนถัดไป

หากการตรวจสอบปริมาณเกลือในบัฟเฟอร์เป็นส่วนหนึ่งของ workflow ของคุณ สามารถดูข้อมูลเพิ่มเติมในบทความ อ่านเพิ่มเติม: Ion Chromatography (IC): การวิเคราะห์ไอออนในน้ำ

กลุ่มโมเลกุลขนาดใหญ่: VLP, AAV และคอมเพล็กซ์มวลสูง

อนุภาคคล้ายไวรัส (VLP), ไวรัสพาหะ AAV และคอมเพล็กซ์โปรตีนขนาดระดับ megadalton ต้องการวัสดุที่มีรูพรุนกว้างและสภาวะการโหลดที่อ่อนโยน ตัวอย่างเหล่านี้จะได้ประโยชน์จากการใช้เครื่องตรวจวัด MALS หรือ Fluorescence เนื่องจากค่าการตอบสนองของ UV ต่ออนุภาคอาจมีความแปรปรวนสูง SEC ระดับเตรียมสารในสเกลนี้จำเป็นต้องใช้คอลัมน์และเรซินที่ออกแบบมาเพื่อลดแรงเฉือนและให้ผลตอบแทนสูง

เมื่อใดที่ควรใช้ SEC และเมื่อใดที่ไม่ควรใช้

เลือกใช้ SEC เมื่อคุณต้องการการแยกตามขนาดภายใต้สภาวะ native, การวิเคราะห์โปรไฟล์ aggregate หรือการกำจัดเกลืออย่างรวดเร็ว หลีกเลี่ยงหากสารเป้าหมายมี hydrodynamic size ใกล้เคียงกันมากเกินไปเนื่องจากความละเอียดจะไม่เพียงพอ หากโจทย์ของคุณเกี่ยวข้องกับ charge variants หรือการเปลี่ยนแปลงหลังการแปลรหัส (post-translational modifications) การใช้วิธีแลกเปลี่ยนไอออน (ion exchange) หรือ affinity จะให้ความจำเพาะที่เหนือกว่า

สำหรับ workflow การทำให้บริสุทธิ์ระดับห้องปฏิบัติการ Resins and LC Media จาก TCI มีตัวเลือกแบบ polymer และ agarose ที่เหมาะสำหรับการขยายสเกลการแยกแบบ SEC วัสดุเหล่านี้สนับสนุนงานเปลี่ยนบัฟเฟอร์และการกำจัดเกลือที่การนำคอลัมน์กลับมาใช้ใหม่และการกู้คืนตัวอย่างมีความสำคัญไม่แพ้ความละเอียดในการแยกสาร

สรุป: สาระสำคัญสำหรับการแยกโปรตีนตามขนาด

size exclusion chromatography สำหรับ protein analysis ช่วยให้เกิดการแยกสารแบบ isocratic ที่ไม่รบกวนโมเลกุล ซึ่งเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการวิเคราะห์โปรไฟล์ aggregate, การศึกษา oligomerization และการกำจัดเกลือ ควรจับคู่ขนาดรูพรุนและช่วงการแยกของคอลัมน์ให้ตรงกับโปรตีนที่คุณต้องการวิเคราะห์ และเลือกบัฟเฟอร์ที่ช่วยยับยั้ง secondary interactions

ตรวจสอบความถูกต้องของแต่ละวิธีด้วยมาตรฐานโปรตีนที่เหมาะสมภายใต้สภาวะเดียวกันกับตัวอย่างของคุณ รักษาปริมาตรการฉีดให้เหมาะสม ตรวจสอบแรงดันในระหว่างการรัน และใช้ guard column เมื่อใช้ตัวอย่างที่ยังไม่ผ่านการทำบริสุทธิ์ นิสัยเหล่านี้จะช่วยให้ผลลัพธ์ทำซ้ำได้ในทุก batch และเปรียบเทียบระหว่างเครื่องมือได้แม่นยำ

ด้วยคอลัมน์ บัฟเฟอร์ และ workflow ที่เหมาะสม size exclusion chromatography สำหรับ protein analysis จะมอบข้อมูลที่รวดเร็วและเชื่อถือได้ ซึ่งตอบโจทย์ทั้งการปล่อยผลผลิตภัณฑ์ QC และงานวิจัยเชิงลึก

คำถามที่พบบ่อย

ฉันควรเลือกขนาดรูพรุนหรือช่วงการแยกอย่างไรสำหรับแอนติบอดี 150 kDa?

เลือกคอลัมน์ที่มีช่วงการแยกที่ครอบคลุม 150 kDa ได้อย่างสบาย โดยให้ monomer อยู่ใกล้จุดกึ่งกลางของหน้าต่างการแยก วิธีนี้จะทำให้ IgG monomer, dimer และ aggregates ขนาดใหญ่กว่าอยู่ในพื้นที่การแยก แทนที่จะชะออกมาพร้อมกันใกล้กับ void หรือ total permeation volume คอลัมน์ SEC สำหรับ IgG ส่วนใหญ่ออกแบบมาเพื่อช่วง 10 ถึง 500 kDa ซึ่งครอบคลุมการใช้งานนี้ได้เป็นอย่างดี

บัฟเฟอร์ที่ควรใช้สำหรับ SEC ของโปรตีนในสภาวะ native คืออะไร?

ใช้ 20 ถึง 100 mM ฟอสเฟตหรือบัฟเฟอร์ Tris ที่มี 100 ถึง 300 mM NaCl โดยเลือกค่า pH ที่รักษาความเสถียรและความสามารถในการละลายของโปรตีน การเติมเกลือจะช่วยยับยั้งอันตรกิริยาทางประจุระหว่างโปรตีนกับ matrix ของคอลัมน์ ซึ่งหากไม่ทำเช่นนั้นอาจทำให้พีกเลื่อนหรือมีหาง หากยังพบพีกมีหางอยู่ ให้เพิ่มความเข้มข้นของเกลือหรือตรวจสอบว่าค่า pH ใกล้เคียงกับจุดไอโซอิเล็กทริกของโปรตีนหรือไม่

ฉันจะ Calibration SEC เพื่อประมาณค่าน้ำหนักโมเลกุลได้อย่างไร?

รันชุดมาตรฐานโปรตีนที่ครอบคลุมช่วงน้ำหนักโมเลกุลที่คุณต้องการ และคำนวณ Kd ของแต่ละตัว จากนั้นพลอตกราฟ log(MW) เทียบกับ Kd เพื่อสร้างเส้นโค้งการ Calibration ควรทำการรันมาตรฐานภายใต้คอลัมน์ บัฟเฟอร์ อัตราการไหล และอุณหภูมิเดียวกันกับตัวอย่างของคุณเสมอ เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงใดๆ จะทำให้ค่า retention เปลี่ยนแปลงไป

ทำไมพีก monomer ของฉันถึงมีหางหรือเลื่อนใน SEC?

Secondary interactions เป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุด ให้เพิ่มความเข้มข้นของไอออน, ปรับ pH ให้ห่างจากจุดไอโซอิเล็กทริกของโปรตีน, ลดปริมาณตัวอย่าง หรือเปลี่ยนไปใช้เรซินที่ชอบน้ำมากขึ้นเพื่อปรับปรุงความสมมาตรของพีก หากการเลื่อนของพีกคงที่ในทุกความเข้มข้น แสดงว่าช่วงการแยกของคอลัมน์อาจไม่ครอบคลุมขนาดของโปรตีนอย่างถูกต้อง

ฉันสามารถรัน size exclusion chromatography บนระบบ HPLC มาตรฐานได้หรือไม่?

ได้ SEC รันแบบ isocratic และเข้ากันได้กับระบบ HPLC ส่วนใหญ่ แม้ว่าทางเดินสารแบบ bio-inert (PEEK หรือไทเทเนียม) จะเป็นที่ต้องการมากกว่าเมื่อทำงานกับโปรตีนที่ไวต่อโลหะ การตรวจวัด UV ที่ 280 nm เหมาะสำหรับงานโปรตีนส่วนใหญ่ เครื่องตรวจวัด Refractive Index (RI) หรือ MALS จะช่วยให้ทราบค่ามวลโดยไม่ขึ้นกับความเข้มข้น ซึ่งเหมาะสำหรับตัวอย่างที่หลากหลาย

ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ

ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค

Merck

LiChroprep® Sorbent

ดูเพิ่มเติม →

TCI

Resins and LC Media