Anti-Mouse Secondary Antibody คืออะไร? วิธีเลือกและใช้งานในห้องแล็บ
อ่านประมาณ 13 นาที••โดย Chemical Express Thailand
การใช้ Mouse primary antibody เป็นเรื่องปกติในงาน Western blot, IHC และ ELISA แต่การเลือกใช้ anti mouse antibody secondary ที่ไม่ถูกต้องอาจทำให้เกิดสัญญาณรบกวน (background noise) และทำให้การทดลองที่ใช้เวลานานต้องเสียเปล่า การเลือกคอนจูเกต (conjugate) ประเภท HRP, AP หรือฟลูออโรฟอร์ให้เหมาะสมกับซับสเตรต เครื่องมือ และชนิดเนื้อเยื่อของคุณมีความสำคัญอย่างยิ่ง บทความนี้จะอธิบายถึงแนวทางการเลือก anti mouse antibody secondary HRP selection พร้อมแนะนำรูปแบบ antibody ที่สำคัญ รวมถึงขั้นตอนการปฏิบัติงานและคำแนะนำในการแก้ไขปัญหา เพื่อให้ผลการทดลองของคุณมีความน่าเชื่อถือ
Anti-mouse secondary antibody คืออะไรและทำไมคุณจึงจำเป็นต้องใช้?
กระบวนการ anti mouse antibody secondary HRP selection ที่ถูกต้องเริ่มต้นจากการทำความเข้าใจหน้าที่ของน้ำยา (reagent) ชนิดนี้ Anti-mouse secondary antibody คือ antibody ที่ถูกสร้างขึ้นในสัตว์โฮสต์ที่ไม่ใช่หนู (non-mouse host) เช่น แพะ กระต่าย หรือลา เพื่อให้มีความจำเพาะต่ออิมมูโนโกลบูลิน (immunoglobulin) ของหนู โดยจะจับกับบริเวณ Fc region หรือไอโซไทป์เฉพาะของ Mouse primary antibody ที่คุณใช้จับกับกลุ่มตัวอย่างไปก่อนหน้านี้แล้ว
โดยปกติ secondary antibody จะถูกติดฉลาก (label) ด้วยเอนไซม์ เช่น HRP (Horseradish Peroxidase) หรืออัลคาไลน์ฟอสฟาเทส (Alkaline Phosphatase) หรืออาจเป็นฟลูออโรฟอร์ (fluorophore) หรือไบโอติน (biotin) เพื่อใช้ในการขยายสัญญาณ ซึ่งฉลากเหล่านี้จะทำให้เกิดสัญญาณที่คุณสามารถตรวจวัดได้ผ่านการเรืองแสง (chemiluminescence), ปฏิกิริยาสี (colorimetric) หรือการถ่ายภาพเรืองแสง (fluorescence imaging)
คุณจำเป็นต้องใช้ secondary antibody เมื่อ Mouse primary antibody ของคุณไม่ได้ติดฉลากโดยตรง หรือเมื่อต้องการความไว (sensitivity) ในการตรวจวัดที่สูงขึ้น กล่าวโดยสรุปคือ มันคือตัวเปลี่ยนขั้นตอนการตรวจวัดที่ไม่มีฉลากให้กลายเป็นสัญญาณที่สามารถอ่านค่าได้ในงาน WB, IHC, ELISA และ immunofluorescence
กลไกการทำงานของ anti-mouse secondary และรูปแบบที่มีให้เลือก
หลักการขยายสัญญาณมีความเรียบง่าย โดยโมเลกุลของ secondary antibody หลายโมเลกุลจะเข้าไปจับกับ primary antibody หนึ่งโมเลกุล ทำให้ความหนาแน่นของฉลากเพิ่มขึ้น ผลกระทบจากการสะสมนี้ช่วยเพิ่มความเข้มของสัญญาณเมื่อเปรียบเทียบกับการใช้ primary antibody ที่ติดฉลากโดยตรง ซึ่งเป็นเหตุผลว่าทำไม secondary antibody จึงยังคงเป็นตัวเลือกมาตรฐานสำหรับงานตรวจวิเคราะห์ส่วนใหญ่
Polyclonal secondary antibody สามารถจดจำอิพิโทป (epitope) ได้หลายจุดบนเมาส์ IgG ทำให้ได้สัญญาณที่แรงแต่มีความแปรปรวนระหว่างลอตเล็กน้อย ในขณะที่ Monoclonal secondary antibody จะมุ่งเป้าไปยังอิพิโทปเดียวเพื่อความสม่ำเสมอของลอตที่ดีกว่า นอกจากนี้ยังมีรูปแบบ F(ab')2 และ Fab fragment ที่ไม่มีส่วน Fc region ซึ่งมีความสำคัญอย่างยิ่งในเนื้อเยื่อที่มี Fc receptors สูง เช่น ม้ามหรือต่อมน้ำเหลือง เพื่อป้องกันการจับแบบไม่จำเพาะที่อาจทำให้เกิดสัญญาณรบกวน
การทำ Cross-adsorption เป็นอีกปัจจัยหนึ่งที่ช่วยแยก secondary antibody ที่มีคุณภาพออกจากแบบทั่วไป โดย secondary antibody ที่ผ่านการทำ cross-absorbed กับโปรตีนจากมนุษย์ หนูแรท หรือสัตว์อื่นๆ จะช่วยกำจัด antibody ที่อาจเกิดปฏิกิริยาข้าม (cross-reactivity) ออกไป หากตัวอย่างของคุณประกอบด้วยหลายชนิดพันธุ์หรือเนื้อเยื่อมี endogenous immunoglobulin การใช้ secondary antibody ที่ผ่านการทำ highly cross-adsorbed จึงไม่ใช่แค่ทางเลือก แต่เป็นข้อกำหนดพื้นฐาน
ผลิตภัณฑ์ Secondary Antibodies จาก TCI ครอบคลุมทั้งกลุ่ม Anti-Mouse IgG และ Anti-Mouse IgM รวมถึงรูปแบบ Anti-Rabbit IgG, Anti-Human IgG และ Anti-Chicken IgY ทำให้ห้องปฏิบัติการมีความยืดหยุ่นในการทำ multiplexing หรือสลับประเภท primary antibody ในแต่ละโปรเจกต์
| คุณสมบัติ | Polyclonal / Full IgG | F(ab')2 Fragment | Monoclonal |
|---|---|---|---|
| ความเข้มของสัญญาณ | สูง | ปานกลางถึงสูง | ปานกลาง |
| การจับกับ Fc receptor | ใช่ | ไม่ | ใช่ (ถ้า intact) |
| การใช้งานที่เหมาะสม | WB, ELISA | IHC, IF บนเนื้อเยื่อ | งานที่ต้องการความสม่ำเสมอของลอต |
| ตัวเลือก Cross-adsorption | มีให้เลือก | มีให้เลือก | พบได้น้อยกว่า |
| ประเภทคอนจูเกต | HRP, AP, fluorophore, biotin | HRP, AP, fluorophore | HRP, fluorophore |
แนวทางการทำ anti mouse antibody secondary HRP selection สำหรับ WB, IHC และ ELISA
การเลือก anti mouse antibody secondary HRP selection ขึ้นอยู่กับการตัดสินใจ 3 ประการ ได้แก่ รูปแบบการทดลอง (assay format), ชนิดพันธุ์ของตัวอย่าง และซับสเตรตหรือเครื่องมือที่ใช้ การจัดการทั้งสามส่วนให้ถูกต้องตามลำดับจะช่วยป้องกันปัญหาเรื่องสัญญาณและสัญญาณรบกวนส่วนใหญ่ได้
การเลือกประเภทคอนจูเกตตามรูปแบบการทดลอง
HRP เหมาะสมกับงาน WB ที่ใช้ ECL, งาน IHC ที่ใช้ DAB และงาน ELISA ที่ใช้ TMB เนื่องจากให้จลนศาสตร์ที่รวดเร็วและสัญญาณที่แรงหากจัดการอย่างถูกต้อง ในขณะที่ Alkaline Phosphatase จะเหมาะสมกว่าเมื่อในบัฟเฟอร์มีโซเดียมเอไซด์ (sodium azide) หรือเมื่อต้องการเวลาในการพัฒนาสีที่นานขึ้น สำหรับฟลูออโรฟอร์คอนจูเกตจะเหมาะกับงาน immunofluorescence และ flow cytometry ที่ต้องการความละเอียดในเชิงตำแหน่งหรือการทำ multiplexing
คู่มือการเลือกอย่างรวดเร็ว: คอนจูเกตประเภทไหนเหมาะกับงานของคุณ?
- Western blot ที่ใช้ ECL หรือ chemiluminescent substrate
- IHC ที่ใช้ DAB หรือ AEC chromogen
- ELISA ที่ใช้ TMB หรือ OPD substrate
- พัฒนาผลได้รวดเร็วพร้อมความไวสูง
- งานที่มีส่วนประกอบของเอไซด์ (azide) ในบัฟเฟอร์ล้าง
- BCIP/NBT colorimetric IHC หรือ dot blot
- กรณีที่ต้องการเวลาในการพัฒนาสีนานขึ้น
- ตัวอย่างที่เอนไซม์ peroxidase ภายในเนื้อเยื่อ (endogenous peroxidase) รบกวนการทดลอง
- Immunofluorescence โดยใช้กล้อง confocal หรือ widefield
- Flow cytometry
- การตรวจวัดแบบ multiplex ด้วย primary antibody ตั้งแต่สองชนิดขึ้นไป
- การศึกษาการอยู่ร่วมกันของโปรตีน (co-localization)
ชนิดสัตว์โฮสต์และการทำ Cross-adsorption
แพะ กระต่าย และลา เป็นสัตว์โฮสต์ที่พบบ่อยที่สุดสำหรับ anti-mouse secondary หากตัวอย่างของคุณมีเนื้อเยื่อมนุษย์หรือหนูแรทปนอยู่ ควรเลือก secondary antibody ที่ผ่านการทำ highly cross-adsorbed กับสัตว์ชนิดนั้นๆ หากไม่ทำเช่นนั้น secondary antibody จะเข้าไปจับกับอิมมูโนโกลบูลินภายในเนื้อเยื่อและทำให้เกิดสัญญาณรบกวนที่กว้างและสูง ซึ่งแก้ไขได้ยากมาก
ไอโซไทป์ ความจำเพาะ และสัดส่วนการเจือจาง
Pan-IgG secondary antibody สามารถใช้ได้กับการทดลองที่ใช้ primary antibody เพียงชนิดเดียว ส่วนการทดลองแบบ multiplex ที่ใช้ primary antibody จากหนูหลายชนิดที่มีไอโซไทป์ต่างกัน ควรใช้ subclass-specific secondary antibody เช่น anti-mouse IgG1 หรือ IgG2a เพื่อหลีกเลี่ยงการเกิดปฏิกิริยาข้ามระหว่างช่องสัญญาณ (channel) การใช้ affinity-purified secondary antibody จะให้การจับที่สม่ำเสมอในแต่ละลอตและลดสัญญาณรบกวนได้ดีกว่าแบบที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโปรตีน A หรือ G
| รูปแบบการทดลอง | คอนจูเกต | สัดส่วนการเจือจางที่แนะนำ | ซับสเตรต |
|---|---|---|---|
| Western blot | HRP | 1:10,000 (range: 1:5,000 to 1:20,000) | ECL / chemiluminescent |
| IHC | HRP | 1:500 (range: 1:200 to 1:1,000) | DAB or AEC |
| ELISA | HRP | 1:5,000 (range: 1:2,000 to 1:10,000) | TMB or OPD |
| Immunofluorescence | Fluorophore | 1:500 (range: 1:200 to 1:1,000) | Imaging buffer / mounting media |
การเลือก Blocking buffer ก็ส่งผลต่อผลลัพธ์เช่นกัน สำหรับงานตรวจหา phospho-target ใน WB ให้เลือกใช้ blocking ที่มีพื้นฐานจาก BSA แทนการใช้นม เพราะเคซีน (casein) ในนมมีฟอสโฟรีเลชั่นซึ่งอาจรบกวนสัญญาณของ phospho-antibody สำหรับ IHC ให้ใช้เซรั่มปกติที่ตรงกับชนิดสัตว์โฮสต์ของ secondary antibody เพื่อลดการจับแบบไม่จำเพาะกับเนื้อเยื่อ
โปรโตคอล การแก้ไขปัญหา การเก็บรักษา และคำแนะนำในการจัดซื้อ
ขั้นตอนสำคัญของโปรโตคอล
กระบวนการโดยทั่วไปของงาน WB, IHC และ ELISA เริ่มจากการทำ blocking ด้วยบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมเป็นเวลา 30 ถึง 60 นาที จากนั้นฟัก (incubate) ด้วย Mouse primary antibody ตามสัดส่วนที่ผ่านการตรวจสอบแล้ว ล้างด้วย TBST หรือ PBST 3 ถึง 5 ครั้ง ก่อนเติม anti-mouse secondary antibody ตามความเข้มข้นที่เหมาะสม หลังจากล้างเสร็จแล้วจึงพัฒนาผลด้วย ECL, DAB หรือ TMB ตามรูปแบบที่คุณเลือก
เคล็ดลับอย่างรวดเร็ว
- ใช้เวลา blocking และบัฟเฟอร์ที่มีส่วนประกอบเหมือนกันในทุกรอบการทดลองเพื่อให้เปรียบเทียบสัญญาณระหว่าง run ได้
- เขย่าหรือคนเบาๆ ในระหว่างการฟัก secondary antibody เพื่อป้องกันการจับที่ไม่สม่ำเสมอบนแผ่นเมมเบรนหรือหลุม plate
- ล้างแผ่นให้สะอาดด้วยบัฟเฟอร์ที่มี Tween เพราะการล้างที่ไม่สะอาดเป็นสาเหตุหลักของการเกิดพื้นหลังสูง
- ป้องกัน secondary antibody ที่คอนจูเกตกับฟลูออโรฟอร์ไม่ให้โดนแสงทันทีหลังเติมและตลอดขั้นตอนที่เหลือ
- รอให้รีเอเจนต์ที่เก็บในตู้เย็นมีอุณหภูมิเท่ากับอุณหภูมิห้องก่อนใช้งาน ยกเว้นกรณีที่โปรโตคอลระบุให้ใช้อุณหภูมิต่ำ
- ทำ Titration เพื่อหาสัดส่วนที่เหมาะสมของทั้ง primary และ secondary antibody โดยปรับทีละตัวแปรเพื่อให้ตีความผลลัพธ์ได้แม่นยำ
กฎการใช้งาน HRP
การแก้ไขปัญหาทั่วไป
สัญญาณรบกวนพื้นหลังสูงมักเกิดจากการเจือจาง secondary antibody น้อยเกินไป เวลาในการ blocking ไม่เพียงพอ หรือการทำ cross-adsorption ไม่ดีพอ สัญญาณที่อ่อนหรือไม่มีสัญญาณมักมาจากการล้างมากเกินไป ซับสเตรตหมดอายุ หรือการเจือจาง primary antibody มากเกินไป ส่วนแถบสัญญาณที่ไม่ได้จำเพาะ (non-specific banding) ใน WB มักเกิดจากการจับกับ Fc receptor หรือความไม่เข้ากันของไอโซไทป์ระหว่าง secondary และ primary antibody
| ปัญหา | สาเหตุที่เป็นไปได้ | วิธีแก้ไข |
|---|---|---|
| สัญญาณพื้นหลังสูง | เจือจาง secondary น้อยเกินไปหรือการ cross-adsorption ไม่ดี | เจือจางเพิ่มขึ้น; เปลี่ยนไปใช้ secondary แบบ highly cross-adsorbed |
| สัญญาณอ่อน | ล้างมากเกินไป, ซับสเตรตหมดอายุ, หรือเจือจาง primary มากเกินไป | ลดจำนวนรอบการล้าง; ตรวจสอบความสดของซับสเตรต; ทำ titration primary ใหม่ |
| แถบสัญญาณไม่จำเพาะ | Fc binding หรือไอโซไทป์ไม่ตรงกัน | ใช้ secondary ชนิด F(ab')2; ตรวจสอบไอโซไทป์ของ primary antibody |
| ไม่มีสัญญาณในงาน HRP | ถูกยับยั้งด้วยเอไซด์หรือการปนเปื้อนของเปอร์ออกไซด์ | กำจัดเอไซด์จากบัฟเฟอร์ทั้งหมด; ใช้ซับสเตรตใหม่ |
การเก็บรักษาและการจัดซื้อ
จัดเก็บสต็อก antibody ในรูปแบบของเหลวที่อุณหภูมิ 2 ถึง 8°C หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ เพราะจะทำให้กิจกรรมของคอนจูเกตเสื่อมลง ควรแบ่งใส่หลอดขนาดเล็ก (aliquot) สำหรับใช้ครั้งเดียว และเก็บสารที่คอนจูเกตกับฟลูออโรฟอร์ไว้ในหลอดทึบแสงหรือห่อด้วยฟอยล์ตลอดเวลา
สำหรับห้องปฏิบัติการในไทยที่ดำเนินงาน WB, IHC, ELISA และ IF ทาง Chemical Express TH มีจำหน่าย Secondary Antibodies จากแคตตาล็อกของ TCI ซึ่งครอบคลุมทั้ง Anti-Mouse IgG, Anti-Mouse IgM และรูปแบบอื่นๆ พร้อมตัวเลือก HRP, AP และฟลูออเรสเซนต์คอนจูเกต การสั่งซื้อผ่านตัวแทนจำหน่ายในพื้นที่ช่วยลดระยะเวลาการขนส่งและช่วยให้งานด้านเอกสารการนำเข้าของทีมจัดซื้อสะดวกยิ่งขึ้น
เครื่องแก้วที่สะอาดจะช่วยลดแหล่งกำเนิดสัญญาณรบกวนในงาน ELISA และ Blot สารตกค้างจากผงซักฟอกหรือการทดลองก่อนหน้าในจาน หลอด และเครื่องแก้วสามารถรบกวนปฏิกิริยาของซับสเตรตและเพิ่มสัญญาณลวงได้ Extran® Detergents by Merck ได้รับการออกแบบมาเพื่อการล้างเครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการอย่างหมดจดและเข้ากันได้กับงานวิเคราะห์ที่มีความละเอียดอ่อน
หากการจัดซื้อของห้องปฏิบัติการของคุณยังรวมถึงการติดตามตรวจสอบสิ่งแวดล้อมนอกเหนือจากสารเคมีสำหรับการตรวจวิเคราะห์ภูมิคุ้มกัน (immunoassay) คุณสามารถสั่งซื้อ Radiello® Passive Air Samplers by Merck ได้ผ่านช่องทางเดียวกัน ซึ่งช่วยรวมการสั่งซื้อสำหรับห้องปฏิบัติการที่จัดการทั้งงานเคมีวิเคราะห์และวัสดุสิ้นเปลืองด้านวิทยาศาสตร์ชีวภาพภายใต้รอบการจัดซื้อเดียว
ประเด็นสำคัญเพื่อการเลือกและใช้งานอย่างมั่นใจ
ความสำเร็จในการเลือก anti mouse antibody secondary HRP selection ขึ้นอยู่กับการตัดสินใจสามขั้นตอนตามลำดับ ขั้นแรก ตรวจสอบให้แน่ใจว่า primary antibody เป็นชนิด mouse และระบุชนิดของตัวอย่าง ขั้นที่สอง เลือก HRP, AP หรือฟลูออโรฟอร์ให้ตรงกับซับสเตรตและเครื่องมือตรวจวัด ขั้นที่สาม ทำ titration เพื่อหาความเข้มข้นที่เหมาะสมก่อนเริ่มการทดลองจริง และปฏิบัติตามกฎการใช้งาน HRP อย่างเคร่งครัดเพื่อรักษาคุณภาพสัญญาณในทุกรอบการทดลอง
Secondary antibody ที่ตรงกับโฮสต์ของคุณ ตรงตามความต้องการด้าน cross-adsorption และรูปแบบการตรวจวัด ไม่ใช่แค่รายละเอียดเล็กน้อยในการจัดซื้อ แต่มันคือตัวแปรสำคัญที่กำหนดว่าข้อมูลของคุณจะสะอาด ทำซ้ำได้ และพร้อมสำหรับการตีพิมพ์หรือไม่
คำถามที่พบบ่อย
ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค
ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express
เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ Secondary Antibodies & Contrals จาก MedChemExpress(MCE), TCI, Elabscience และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลols หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE