Direct ELISA คืออะไร? หลักการ ขั้นตอน และการเปรียบเทียบกับ Indirect ELISA
การเลือกรูปแบบ ELISA ที่ไม่เหมาะสมอาจทำให้คุณสูญเสียทั้งเวลา สารเคมี และบางครั้งอาจหมายถึงการทดลองทั้งหมดของคุณ แม้ว่า Direct และ Indirect ELISA จะดูคล้ายกันในทางทฤษฎี แต่ในทางปฏิบัติห้องปฏิบัติการกลับมีพฤติกรรมที่แตกต่างกันอย่างสิ้นเชิง บทความนี้จะอธิบายถึง direct ELISA หลักการ ขั้นตอนการปฏิบัติงานจริงพร้อมการควบคุม และการเปรียบเทียบที่ชัดเจนกับ Indirect ELISA เพื่อให้คุณสามารถเลือกรูปแบบที่เหมาะสมสำหรับการทดลองได้อย่างมั่นใจ
ความหมายของ Direct ELISA และความแตกต่างจาก Indirect ELISA
เรามาเริ่มทำความเข้าใจเกี่ยวกับ direct ELISA หลักการ ขั้นตอน และการเปรียบเทียบกัน โดย Direct ELISA คือการนำแอนติเจนมาตรึงไว้โดยตรงบนหลุมของเพลท จากนั้นจึงตรวจวัดด้วยปฐมภูมิแอนติบอดี (primary antibody) ที่ติดฉลากเอนไซม์เพียงชนิดเดียว หลังจากขั้นตอนการล้าง สารตั้งต้น (substrate) จะทำปฏิกิริยาจนเกิดสัญญาณที่วัดค่าได้ ซึ่งกระบวนการนี้ไม่จำเป็นต้องใช้ทุติยภูมิแอนติบอดี (secondary antibody) เลย
กระบวนการจับแบบขั้นตอนเดียวนี้นอกจากจะช่วยย่อขั้นตอนการทำงานให้สั้นลงแล้ว ยังช่วยลดความเสี่ยงของการเกิด cross-reactivity จากทุติยภูมิแอนติบอดีอีกด้วย อย่างไรก็ตาม ข้อแลกเปลี่ยนคือสัญญาณที่ได้จะมีระดับต่ำกว่า เพราะแอนติบอดีที่ติดฉลากเพียงหนึ่งตัวจะให้สัญญาณที่น้อยกว่าระบบแอนติบอดีแบบขยายสัญญาณ (amplified secondary antibody system)
ในทางกลับกัน Indirect ELISA จะมีการเติมทุติยภูมิแอนติบอดีที่ติดฉลากเข้าไปหลังจากใช้ปฐมภูมิแอนติบอดีชนิดที่ไม่ได้ติดฉลาก ซึ่งขั้นตอนพิเศษนี้จะช่วยขยายสัญญาณให้แรงขึ้นและเพิ่มความยืดหยุ่นในการใช้รีเอเจนต์ทุติยภูมิชนิดเดียวกับปฐมภูมิแอนติบอดีหลายชนิด สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับรูปแบบ ELISA และบทบาทในการวิจัย สามารถดูได้ที่ ELISA คืออะไร? หลักการ ประเภท และการใช้งานในห้องปฏิบัติการไทย
direct ELISA หลักการ: การเคลือบแอนติเจน การบล็อก และการสร้างสัญญาณ
แอนติเจนจะถูกดูดซับโดยตรงบนหลุมพอลิสไตรีนที่มีคุณสมบัติจับโปรตีนได้สูง (high-binding) จากนั้นเพลทจะถูกบล็อกด้วยบัฟเฟอร์โปรตีน เช่น BSA, เคซีน (casein) หรือเจลาตินจากปลา เพื่อปิดพื้นที่ว่างบนพื้นผิวและป้องกันไม่ให้แอนติบอดีตรวจวัดมาจับแบบไม่จำเพาะ
จากนั้นเติมปฐมภูมิแอนติบอดีที่เชื่อมต่อกับเอนไซม์ ซึ่งมักเป็น HRP หรือ AP ลงในหลุมที่บล็อกไว้ เพื่อให้จับกับแอนติเจนที่ตรึงไว้ได้อย่างจำเพาะเจาะจง แล้วจึงล้างคอนจูเกต (conjugate) ส่วนเกินออก
ในขั้นตอนสุดท้าย ให้เติมสารตั้งต้นเพื่อสร้างสัญญาณสี หากใช้ HRP คอนจูเกต นิยมใช้ TMB และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 nm หลังจากเติมสารหยุดปฏิกิริยา (stop solution) ส่วนในกรณีของ AP คอนจูเกต จะใช้ pNPP และวัดที่ 405 nm โดยไม่จำเป็นต้องใช้สารหยุดปฏิกิริยา ซึ่งค่าความเข้มแสงจะถูกนำไปเปรียบเทียบกับ blank หรือกราฟมาตรฐาน (standard curve) เพื่อให้ได้ผลลัพธ์เชิงปริมาณหรือกึ่งปริมาณ
ขั้นตอนการปฏิบัติงานของ Direct ELISA: Workflow, การควบคุม และการปรับสภาวะ
ขั้นตอนหลัก
เริ่มต้นด้วยการเลือกเพลทพอลิสไตรีนชนิดจับสูง เคลือบหลุมด้วยแอนติเจนที่เจือจางใน carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6) หรือ PBS ที่ความเข้มข้นที่เหมาะสม (โดยปกติคือ 1 ถึง 10 µg/mL) บ่มข้ามคืนที่ 4°C หรือบ่ม 1 ถึง 2 ชั่วโมงที่ 37°C
ทิ้งสารเคลือบ ล้างเพลท แล้วบล็อกด้วยบัฟเฟอร์โปรตีนที่คุณเลือกนาน 1 ถึง 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากนั้นเติมปฐมภูมิแอนติบอดีที่ติดฉลากเอนไซม์ บ่ม ล้างอย่างระมัดระวัง เติมสารตั้งต้น หยุดปฏิกิริยา (หากจำเป็น) และอ่านค่าการดูดกลืนแสงทันที
วางแผนการวางตำแหน่งในเพลท (plate map) ก่อนเริ่มปิเปต โดยควรทำซ้ำ (duplicate) หรือสามซ้ำ (triplicate) สำหรับตัวอย่าง และต้องเว้นหลุมไว้สำหรับ blank, negative control, positive control และจุดสำหรับสร้างกราฟมาตรฐานเสมอ
Merck ELISA Kits จาก Sigma-Aldrich ซึ่งจัดจำหน่ายโดย Chemical Express Thailand มีความเข้มข้นของรีเอเจนต์ที่ปรับมาให้เหมาะสมและมีแผนผังการทดลองที่ผ่านการตรวจสอบมาแล้วสำหรับเป้าหมายที่หลากหลาย ตั้งแต่ cytokines เช่น Human IL-6 และ Human TNF-α ไปจนถึงสารบ่งชี้ทางเมตาบอลิซึม เช่น Human Insulin และ Human Leptin การใช้ชุดคิทที่ผ่านการตรวจสอบแล้วจะช่วยลดรอบการทำ Titration และช่วยให้คุณได้รับข้อมูลที่แปลผลได้เร็วขึ้น
การควบคุมคุณภาพ (QC)
การมี Positive control เช่น วัสดุอ้างอิงที่ผ่านการรับรอง หรือแอนติเจนที่มีคุณลักษณะเฉพาะ จะช่วยยืนยันว่าการทดสอบทำงานได้อย่างถูกต้อง ส่วน Negative control ที่เคลือบด้วยบัฟเฟอร์เพียงอย่างเดียวจะช่วยยืนยันว่าระดับ background ต่ำเพียงพอ ในขณะที่หลุม Blank ซึ่งมีเพียงสารตั้งต้นจะทำหน้าที่กำหนด baseline absorbance
หากต้องการการวัดเชิงปริมาณ ให้เตรียมกราฟมาตรฐานจากการเจือจางแอนติเจนบริสุทธิ์อย่างน้อย 5 ถึง 7 จุด และติดตามค่าสัมประสิทธิ์ความแปรผัน (CV) ระหว่างซ้ำ ทั้งนี้ควรกำหนดเกณฑ์การยอมรับก่อนเริ่มการทดลอง โดยทั่วไปค่า CV ไม่ควรเกิน 15% ภายในเพลทเดียวกัน และไม่ควรเกิน 20% ระหว่างเพลท
พารามิเตอร์สำหรับการปรับสภาวะ
| พารามิเตอร์ | ช่วงที่เหมาะสม | หมายเหตุ |
|---|---|---|
| ความเข้มข้นในการเคลือบ (Coating) | 1 ถึง 10 µg/mL | ทำการ Titrate เพื่อป้องกันการเคลือบมากเกินไป ซึ่งอาจบดบัง epitopes ได้ |
| การบ่มสารเคลือบ | 1 ถึง 2 ชั่วโมงที่ 37°C หรือข้ามคืนที่ 4°C | การบ่มข้ามคืนช่วยเพิ่มความสม่ำเสมอในการดูดซับ |
| บัฟเฟอร์สำหรับการบล็อก | BSA (1 ถึง 5%), เคซีน, หรือเจลาตินจากปลา | เลือกสารบล็อกให้เข้ากับคอนจูเกต หลีกเลี่ยง BSA หากใช้แอนติบอดีต้าน BSA |
| ระยะเวลาในการบล็อก | 1 ถึง 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง | การบล็อกนานขึ้นช่วยลด background ในตัวอย่างที่ซับซ้อน |
| การเจือจางปฐมภูมิแอนติบอดี | 1:500 ถึง 1:5,000 (Titrate ตาม Lot) | เจือจางน้อยเกินไปจะเพิ่ม background เจือจางมากเกินไปสัญญาณจะหาย |
| อุณหภูมิในการบ่ม | อุณหภูมิห้อง หรือ 37°C | ควรทำให้เป็นมาตรฐานเดียวกันเพื่อความแม่นยำในการทำซ้ำ |
| รอบการล้าง | 3 ถึง 5 รอบด้วย PBST หรือ TBST | การล้างไม่เพียงพอเป็นสาเหตุหลักของค่า background ที่สูง |
| การสร้างสี (Substrate) | 10 ถึง 30 นาที ที่อุณหภูมิห้องในที่มืด | หยุดปฏิกิริยาด้วย H₂SO₄ สำหรับ TMB แล้วอ่านที่ 450 nm |
| ความยาวคลื่นที่ใช้วัด | 450 nm (TMB/HRP) หรือ 405 nm (pNPP/AP) | ใช้ความยาวคลื่นอ้างอิง 620 ถึง 650 nm เพื่อแก้สัญญาณรบกวน |
เคล็ดลับสำหรับการปฏิบัติ
- ใช้เพลท high-binding เท่านั้น เพลทชนิดอื่นจะลดความสม่ำเสมอในการจับแอนติเจน
- ปรับอุณหภูมิรีเอเจนต์ทั้งหมดให้เท่ากับอุณหภูมิห้องก่อนใช้งานเพื่อป้องกันหยดน้ำที่เกิดขึ้นจากอุณหภูมิ
- ทำ Titration สำหรับปฐมภูมิแอนติบอดีใหม่ทุกครั้งเมื่อเปลี่ยน Lot
- ทดสอบบัฟเฟอร์การบล็อกกับชนิดของตัวอย่างของคุณก่อนเริ่มการรันเพลทจริง
- เพิ่มรอบการล้างเป็นห้ารอบหากยังพบค่า background สูง
- หลีกเลี่ยงหลุมบริเวณขอบเพลทสำหรับตัวอย่างที่สำคัญ เนื่องจากขอบเพลทอาจทำให้ค่าดูดกลืนแสงคลาดเคลื่อน 5 ถึง 15%
- สอบเทียบตัวกรองความยาวคลื่นของเครื่องอ่านเพลทเป็นประจำ
direct ELISA หลักการ ขั้นตอน และการเปรียบเทียบกับ Indirect ELISA
ตารางเปรียบเทียบ
รูปแบบ ELISA ไหนที่เหมาะกับงานของคุณ?
- สำหรับการคัดกรองแอนติเจนอย่างรวดเร็ว
- ใช้สำหรับแอนติเจนที่มีปริมาณมากจากแหล่งบริสุทธิ์หรือรีคอมบิแนนท์
- งานที่ไม่กังวลเรื่องชนิดของทุติยภูมิแอนติบอดี
- การเปรียบเทียบในแต่ละ Lot และการตรวจสอบความเสถียร
- เป้าหมายที่มีปริมาณน้อยและต้องการขยายสัญญาณ
- กรณีที่ต้องใช้ปฐมภูมิแอนติบอดีหลายชนิดจากสัตว์ชนิดเดียวกัน
- การทดสอบทางเซรุ่มวิทยาและระดับแอนติบอดี
- ห้องปฏิบัติการที่มีแอนติบอดีปฐมภูมิจำนวนมาก
| คุณสมบัติ | Direct ELISA | Indirect ELISA | Sandwich ELISA |
|---|---|---|---|
| ความไว (Sensitivity) | ปานกลาง | สูงกว่า (ขยายสัญญาณโดย Secondary) | สูงที่สุด (คู่ Capture + Detection) |
| ความยาวของกระบวนการ | สั้นที่สุด | ปานกลาง | ยาวที่สุด |
| รีเอเจนต์แอนติบอดี | ปฐมภูมิแบบติดฉลากหนึ่งตัว | ปฐมภูมิ + ทุติยภูมิแบบติดฉลาก | Capture + Detection ที่ติดฉลาก |
| ความเสี่ยง Cross-reactivity | ต่ำ | ปานกลาง | ต่ำถึงปานกลาง |
| ความยืดหยุ่นในการตรวจ | ต่ำกว่า | สูงกว่า | ต่ำ (ต้องใช้คู่ที่เข้ากันได้) |
| ค่าใช้จ่ายต่อตัวอย่าง | ปานกลางถึงสูง | ต่ำกว่า (ต่อหนึ่งปฐมภูมิ) | สูงที่สุด |
| การใช้งานที่เหมาะสม | คัดกรองแอนติเจนอย่างรวดเร็ว | เซรุ่มวิทยา, แอนติเจนปริมาณน้อย | วิเคราะห์ระดับสาร, ไซโตไกน์ |
การเปรียบเทียบในแง่ของต้นทุน เวลา และความไว
การใช้ Direct ELISA ช่วยลดระยะเวลาที่ต้องใช้จริงและขั้นตอนการล้าง อย่างไรก็ตามคุณต้องมีปฐมภูมิแอนติบอดีที่ผ่านการคอนจูเกตสำหรับแต่ละเป้าหมาย ซึ่งหมายถึงการจัดซื้อรีเอเจนต์ที่ผ่านการคอนจูเกตมาแล้วหรือลงทุนในการทำ Conjugation chemistry ด้วยตนเอง
ในขณะที่ Indirect ELISA สามารถกระจายต้นทุนของคอนจูเกตไปสู่แอนติบอดีปฐมภูมิได้หลายชนิด ตัวอย่างเช่น Secondary antibody ต้านกระต่ายที่ติดฉลาก HRP เพียงตัวเดียว สามารถรองรับแอนติบอดีปฐมภูมิจากกระต่ายได้ทั้งคลัง และสัญญาณที่ขยายเพิ่มขึ้นยังช่วยได้มากในกรณีที่แอนติเจนมีปริมาณน้อย
เมื่อนำการเปรียบเทียบเรื่อง direct ELISA หลักการ ขั้นตอน ไปประยุกต์ใช้กับโปรเจกต์ของคุณ ควรพิจารณาความเข้มข้นของเป้าหมายเป็นอันดับแรก สำหรับเป้าหมายที่มีความเข้มข้นสูงในตัวอย่างที่บริสุทธิ์ควรเลือก Direct ELISA แต่สำหรับวิเคราะห์ในตัวอย่างที่ซับซ้อน ควรเลือก Indirect หรือ Sandwich
สำหรับคำแนะนำในการเลือกใช้รูปแบบ ELISA ทั้งหมดที่ใช้ในห้องวิจัยไทย สามารถดูได้ที่ ELISA คืออะไร? หลักการ ประเภท และการใช้งานในห้องปฏิบัติการไทย
เมื่อใดควรเลือก Direct ELISA ในงานวิจัยและการควบคุมคุณภาพ
การใช้งานที่เหมาะสมที่สุด
Direct ELISA เหมาะสำหรับการยืนยันแอนติเจนอย่างรวดเร็ว การแยกไอโซไทป์ของเป้าหมายที่มีปริมาณมาก การตรวจสอบความสม่ำเสมอของการเคลือบแอนติเจน และการติดตามการผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ในแต่ละ Batch นอกจากนี้ยังเป็นทางเลือกที่ดีสำหรับการตรวจสอบความเสถียรและการเปรียบเทียบระหว่าง Lot
เมื่อใดควรเปลี่ยนรูปแบบการทดลอง
หากเป้าหมายของคุณมีความเข้มข้นต่ำในซีรั่มหรือเนื้อเยื่อ การใช้ Indirect หรือ Sandwich ELISA จะให้ความไวที่ดีกว่า และหากห้องปฏิบัติการของคุณมีปฐมภูมิแอนติบอดีจำนวนมากพร้อมกับทุติยภูมิคอนจูเกตที่ผ่านการรับรองอยู่แล้ว การใช้ Indirect ELISA จะมีความคุ้มค่ามากกว่า
| ประเภทตัวอย่าง | ระยะเวลาในการทดสอบ | ความสามารถในการรัน |
|---|---|---|
| Purified recombinant antigen | 3 ถึง 4 ชั่วโมง | 96 ถึง 384 หลุม/รอบ |
| Cell culture supernatant | 4 ถึง 5 ชั่วโมง | 96 หลุม |
| Serum หรือ plasma | 4 ถึง 5 ชั่วโมง | 96 หลุม (พร้อมการเจือจาง) |
สำหรับห้องปฏิบัติการในประเทศไทยที่ต้องการลดเวลาในการโอนย้ายวิธี ชุดคิทสำเร็จรูปพร้อมรีเอเจนต์ที่ผ่านการตรวจสอบแล้วจะช่วยลดภาระการปรับสภาวะได้เป็นอย่างมาก ชุดคิท ELISA จาก Merck ที่จัดจำหน่ายโดย Chemical Express Thailand ครอบคลุมเป้าหมายของมนุษย์ เมาส์ และหนู หลากหลายชนิด รวมถึงปริมาตรตัวอย่างที่ใช้เพียง 10 µL
หากต้องการการสนับสนุนด้านการตั้งค่า Immunoassay การสอบเทียบเครื่องอ่านเพลท หรือการเลือกประเภทเพลทที่เหมาะสม สามารถเยี่ยมชมได้ที่ Immunoassay Platform solution
สรุป
Direct ELISA เป็นวิธีที่ช่วยลดเวลาการทดสอบและขจัดปัญหาเรื่อง cross-reactivity จาก Secondary antibody โดยใช้หลักการที่เรียบง่ายแต่ทรงพลัง คุณสามารถใช้ protocol และการควบคุมที่ระบุในบทความนี้เพื่อสร้างมาตรฐานให้กับห้องปฏิบัติการของคุณ
คำถามที่พบบ่อย
ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค
ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express
เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ ELISA Types จาก Merck และ Elabscience และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE
Thai 
English