General Knowledge Molecular Biology & Genetics PCR & Amplification

qPCR คืออะไร? หลักการ Real-Time PCR และการประยุกต์ใช้ในงานวิจัย

อ่านประมาณ 13 นาทีเผยแพร่ 16 มิถุนายน 2026โดย Chemical Express Thailand

เมื่อคุณต้องการข้อมูลการแสดงออกของยีน (gene expression) ภายในวันศุกร์ แต่การถกเถียงเรื่องเคมีภัณฑ์, ชุดควบคุม (controls) และการตั้งค่าบนเครื่องมือกลับทำให้โครงการล่าช้า ความกังวลเรื่องการปนเปื้อนหรือประสิทธิภาพที่ล้มเหลวสร้างความสงสัยเมื่อผลลัพธ์ไม่ตรงกับความเป็นจริงทางชีวภาพ คู่มือนี้จะอธิบายว่า qPCR คืออะไร ในเชิงปฏิบัติ พร้อมทั้งเจาะลึกกลไกเบื้องหลัง และประยุกต์ใช้วิธีการนี้ในงานวิจัยและงานควบคุมคุณภาพ (QC) จริง

qPCR คืออะไร และทำไมห้องปฏิบัติการจึงนิยมใช้

คำถามที่ว่า qPCR คืออะไร ในรูปแบบ Real-Time PCR นั้น คือวิธีการเพิ่มจำนวน DNA เป้าหมายพร้อมกับการวัดสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์ในทุกรอบอุณหภูมิ ทำให้คุณทราบปริมาณ DNA ตั้งต้นได้ตั้งแต่ยังไม่เปิดหลอดทดลอง เครื่องมือจะรายงานค่า Quantification Cycle ซึ่งเรียกว่า Cq หรือ Ct ซึ่งเป็นสัดส่วนผกผันกับจำนวน Copy number เริ่มต้น หากมีแม่แบบมาก สัญญาณฟลูออเรสเซนซ์จะข้ามระดับเกณฑ์การตรวจวัดได้เร็วกว่า ทำให้ได้ค่า Cq ที่ต่ำกว่า

ห้องปฏิบัติการใช้ค่า Cq เทียบกับกราฟมาตรฐาน (standard curve) สำหรับการหาจำนวน Copy number แบบสัมบูรณ์ หรือใช้กับยีนอ้างอิง (reference gene) เพื่อคำนวณการเปลี่ยนแปลงแบบสัมพัทธ์ ทั้งสองแนวทางได้รับการยอมรับและใช้กันอย่างแพร่หลายในงานวิจัยและขั้นตอนการควบคุมคุณภาพ

เมื่อเทียบกับ PCR แบบดั้งเดิม (Endpoint PCR) qPCR ช่วยเพิ่มช่วงการวัด (dynamic range), ลดระยะเวลาในการรอผล และให้สัญญาณการผ่านหรือตกก่อนที่คุณจะก้าวไปสู่ขั้นตอนวิเคราะห์ในลำดับถัดไป ผลลัพธ์ทั่วไปประกอบด้วย amplification plots, ค่า Cq, melt curves สำหรับเทคนิคการใช้สี (dye-based) และการประมาณค่าประสิทธิภาพจากอนุกรมเจือจาง (serial dilutions)

หลักการทำงานของ Real-Time PCR: รอบการเพิ่มจำนวน, การตรวจวัดฟลูออเรสเซนซ์ และข้อมูลเอาต์พุต

แต่ละรอบ PCR จะมีขั้นตอนอุณหภูมิ 3 ขั้น: การแยกสาย DNA (denaturation), การจับของไพรเมอร์ (annealing), และการสร้างสาย DNA ใหม่ (extension) ตัวตรวจวัดทางแสงจะอ่านค่าฟลูออเรสเซนซ์ ณ จุดที่กำหนดในทุกรอบ สัญญาณมักจะคงที่อยู่ใกล้พื้นหลังในตอนแรก ก่อนที่จะพุ่งสูงขึ้นเมื่อการเพิ่มจำนวนเข้าสู่ระยะ Exponential

รอบที่สัญญาณฟลูออเรสเซนซ์ข้ามเกณฑ์ที่กำหนดคือ Cq เนื่องจากแต่ละรอบควรจะเพิ่มจำนวนผลิตผลเป็นเท่าตัว ความแตกต่างเพียงเล็กน้อยในแม่แบบเริ่มต้นจึงทำให้ค่า Cq เปลี่ยนไปตามปริมาณที่คาดการณ์ได้ กราฟมาตรฐานที่สร้างจากอนุกรมเจือจางจะเปลี่ยนค่า Cq เหล่านั้นเป็นจำนวน Copy number จริง ประสิทธิภาพเป็นหัวใจสำคัญทางคณิตศาสตร์ โดยสูตร E = 10^(−1/slope) − 1 ควรอยู่ในช่วง 90 ถึง 110 เปอร์เซ็นต์เพื่อให้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้

สำหรับการทดสอบที่ใช้สี (dye-based) การวิเคราะห์ melt curve จะเกิดขึ้นทันทีหลังการเพิ่มจำนวน โดยจะให้ความร้อนแก่สารผลิตภัณฑ์จากประมาณ 60 °C ถึง 95 °C และบันทึกการลดลงของฟลูออเรสเซนซ์เมื่อ DNA สายคู่แยกตัวออก พีคที่คมชัดเพียงหนึ่งพีคช่วยยืนยันความจำเพาะของผลิตภัณฑ์ ส่วนการใช้โพรบแบบ Multiplex จะข้ามการวิเคราะห์ melt curve ไป โดยแบ่งเป้าหมายตาม fluorophore และช่องสัญญาณการปล่อยแสง ทำให้สามารถตรวจสอบยีนเป้าหมายได้หลายตัวในปฏิกิริยาเดียว

การปรับค่าให้เป็นมาตรฐาน (data normalization) ช่วยให้เปรียบเทียบผลลัพธ์ระหว่างกลุ่มตัวอย่างได้ สำหรับการแสดงออกของยีน วิธี ΔΔCq จะนำสัญญาณเป้าหมายหารด้วยยีนอ้างอิงที่เสถียร เครื่องมือบางรุ่นต้องการ passive reference dye เช่น ROX เพื่อแก้ไขความแตกต่างของปริมาตรในแต่ละหลุม การหักลบพื้นหลัง (baseline subtraction) จะช่วยกำจัดสัญญาณรบกวนในช่วงรอบต้นๆ ก่อนการกำหนดค่า Threshold

แพลตฟอร์ม LightCycler® จาก Roche (ซึ่งมีจำหน่ายผ่านช่องทางของ Merck/Sigma-Aldrich) ช่วยให้ห้องปฏิบัติการสามารถปรับอัตราการเพิ่มอุณหภูมิ, เลือกช่องสัญญาณทางแสง และใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ที่บูรณาการไว้ ซึ่งตอบโจทย์การตัดสินใจสำหรับนักวิจัยเมื่อต้องตอบคำถามว่า qPCR คืออะไร สำหรับการประยุกต์ใช้งานเฉพาะของพวกเขา

พารามิเตอร์	ค่าทั่วไป / แนวทางปฏิบัติ	หมายเหตุเชิงปฏิบัติ
Cq thresholding	อัตโนมัติหรือปรับเอง ให้อยู่ในช่วง Exponential phase	รักษาค่า Threshold ให้คงที่ระหว่างการรันที่เปรียบเทียบกัน
Amplification efficiency	E = 10^(−1/slope) − 1; ช่วงเป้าหมาย 90–110%	คำนวณใหม่เมื่อเปลี่ยนไพรเมอร์หรือเมทริกซ์
Dynamic range	โดยทั่วไป 5–7 ลำดับขั้น	ตรวจสอบด้วยชุดเจือจาง 5 หรือ 6 จุด
Ramp rate	1–6 °C/s ขึ้นอยู่กับเครื่องมือและชุดทดสอบ	ชุดทดสอบแบบเร็วช่วยลดเวลา; ตรวจสอบความจำเพาะของผลิตภัณฑ์
Reaction volume	10–25 µL มาตรฐาน; 5–10 µL สำหรับรูปแบบความหนาแน่นสูง	ปริมาตรที่ต่ำลงต้องการความแม่นยำในการปิเปต
Optical channels	1–6 ขึ้นอยู่กับแพลตฟอร์ม	จับคู่ fluorophore กับฟิลเตอร์ที่มีก่อนสั่งซื้อโพรบ
Passive reference dye	ROX จำเป็นสำหรับเครื่องมือบางรุ่น (เช่น ABI)	ไม่จำเป็นสำหรับแพลตฟอร์ม LightCycler®; ตรวจสอบสูตร Master mix

เคมีภัณฑ์, ชุดควบคุม และการตั้งค่าเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ qPCR ที่เชื่อถือได้

การเปรียบเทียบเคมีภัณฑ์ในการทดสอบ

การเลือกเคมีภัณฑ์เป็นตัวกำหนดขีดจำกัดความจำเพาะและความสามารถในการทำ Multiplex โดยมี 3 ทางเลือกหลัก: SYBR Green, Hydrolysis (TaqMan) probes และ High-resolution melt (HRM)

คู่มือการเลือกเคมีภัณฑ์อย่างรวดเร็ว

SYBR Green

การทดสอบเป้าหมายเดียวด้วยไพรเมอร์ที่ออกแบบมาอย่างดี
งานที่ต้องการควบคุมต้นทุนโดยไม่ต้องสังเคราะห์โพรบ
Melt curve หลังการทดสอบช่วยยืนยันตัวตนของผลิตภัณฑ์
ต้นทุนต่อปฏิกิริยาต่ำ เหมาะสำหรับการคัดกรองปริมาณมาก

Hydrolysis Probes (TaqMan)

ความจำเพาะสูงในกรณีที่มีปัญหา Primer dimers
การแยกแยะ SNP และความแตกต่างของอัลลีล
การทดสอบแบบ Multiplex 2–5 เป้าหมายต่อปฏิกิริยา
งานทางคลินิกและงานภายใต้กฎระเบียบที่ต้องการความเลือกสรรสูง

High-Resolution Melt (HRM)

การสแกนหาความผันแปรโดยไม่มีต้นทุนการออกแบบโพรบ
งานวิจัยด้าน Genotyping และ Methylation
ต้องการเครื่องมือที่รองรับ HRM และสีย้อมชนิดอิ่มตัว
เหมาะสำหรับการคัดกรอง SNP ในระดับประชากร

เคมีภัณฑ์	สีย้อม / โพรบ	Quencher	ความยาวเป้าหมาย (bp)	ช่องสัญญาณตรวจวัด
SYBR Green	Intercalating dye	ไม่ใช้	70–200 bp	1 (สีเขียว)
Hydrolysis probe	FAM, HEX, VIC หรือใกล้เคียง	BHQ-1, TAMRA	60–150 bp	Multiplex ตาม fluorophore
HRM	Saturating intercalating dye	ไม่ใช้	100–400 bp	1 (จำเพาะต่อสี)

KAPA SYBR® FAST qPCR Kit เป็นตัวเลือกแรกที่ใช้งานได้จริงสำหรับกระบวนการทำงานแบบ SYBR รองรับโปรโตคอลการรันแบบรวดเร็ว ซึ่งช่วยลดเวลาโดยไม่ต้องเปลี่ยนการออกแบบชุดไพรเมอร์ ห้องปฏิบัติการที่มีตัวอย่างปริมาณมากจะพบว่าสิ่งนี้มีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการคัดกรองที่ปกติอาจใช้เวลาเครื่องมือหลายชั่วโมง

สำหรับการเตรียม Master mix เอง คุณภาพของ dNTP Mix ส่งผลโดยตรงต่อความแม่นยำ การใช้ dNTP Mix ที่ผ่านการตรวจสอบจะช่วยป้องกันความแปรปรวนระหว่าง Lot ซึ่งอาจส่งผลต่อประสิทธิภาพและทำให้ค่า Cq คลาดเคลื่อนได้ เมื่อพิจารณาถึงตัวทำละลายเกรดรีเอเจนต์สำหรับบัฟเฟอร์สกัดนิวคลีอิกเอซิดในกระบวนการทำงานแบบขนาน ควรตรวจสอบมาตรฐานความบริสุทธิ์เทียบเท่ากับที่อธิบายไว้สำหรับ SupraSolv® high purity solvents เนื่องจากสิ่งปนเปื้อนจากการสกัดอาจยับยั้งการเพิ่มจำนวน DNA ได้

ชุดควบคุมและ QC

ชุดควบคุมที่จำเป็นสำหรับการรัน qPCR ทุกครั้ง: No-template control (NTC) เพื่อตรวจการปนเปื้อนของรีเอเจนต์; No-RT control สำหรับงาน RNA เพื่อป้องกันการปนเปื้อนของ genomic DNA; Positive control เพื่อยืนยันประสิทธิภาพของรีเอเจนต์; กราฟมาตรฐานหรือชุดอนุกรมเจือจางสำหรับการคำนวณประสิทธิภาพ; และการตรวจสอบ Melt curve สำหรับทุกการทดสอบที่ใช้สี

การป้องกันการปนเปื้อนเป็นสิ่งสำคัญ แยกพื้นที่การทำงานก่อนและหลังการเพิ่มจำนวนอย่างชัดเจน ใช้ทิปกันละอองฝอย (aerosol-resistant) และรักษาขั้นตอนการทำงานแบบทิศทางเดียว (unidirectional) เหตุการณ์ละอองฝอยเพียงครั้งเดียวสามารถทำให้ค่า NTC สูงขึ้นและทำลายผลลัพธ์ทั้งเพลทได้

ใช้กฎการยอมรับผลลัพธ์ดังนี้: ประสิทธิภาพระหว่าง 90-110 เปอร์เซ็นต์, ค่า R² ของกราฟมาตรฐานอยู่ที่ 0.99 ขึ้นไป, มีเพียงพีคเดียวใน Melt curve, และไม่มี Primer dimers หรือปรากฏเฉพาะในรอบปลายๆ ที่สูงกว่า Cq 35

เคล็ดลับการตั้งค่าและการปรับปรุงประสิทธิภาพ

เคล็ดลับสั้นๆ

ออกแบบเป้าหมายในช่วง 70–150 bp เพื่อประสิทธิภาพและความเร็วสูงสุด
ตั้งค่าไพรเมอร์ Tm ที่ 60 ± 2 °C เพื่อให้การจับตัวสม่ำเสมอ
ตั้งค่าความเข้มข้นไพรเมอร์สุดท้ายที่ 200–500 nM และปรับระดับหากพบ Dimers
ปรับความเข้มข้น Mg²⁺ หลังจากปรับไพรเมอร์และอุณหภูมิแล้วเท่านั้น
เตรียม Master mix บนน้ำแข็ง และรอให้พลาสติกมีอุณหภูมิห้องก่อนเริ่ม
ตรวจสอบชุดไพรเมอร์ใหม่ทุกครั้งด้วยการเจือจาง 5 หรือ 6 จุดเพื่อยืนยันประสิทธิภาพ
ใช้ ROX passive reference หากเครื่องมือต้องการ
เลือกวิธีสกัดที่สามารถขจัดตัวยับยั้ง PCR เช่น humic acids, haemoglobin หรือ guanidinium salts

เมื่อห้องปฏิบัติการประเมินใหม่ว่า qPCR คืออะไรสำหรับตัวอย่างประเภทใหม่ การเลือกเคมีภัณฑ์และการออกแบบชุดควบคุมต้องสอดคล้องกัน ตัวอย่างเช่น การตรวจจับเชื้อก่อโรคในเมทริกซ์อาหารต้องการการจัดการตัวยับยั้งที่ต่างจากการทดลอง RNA ใน Cell culture

การประยุกต์ใช้งานด้านการวิจัยและ QC ของ qPCR ในห้องปฏิบัติการทางคลินิก, เภสัชกรรม, อาหาร และสิ่งแวดล้อม

การศึกษาการแสดงออกของยีนและ Copy number

การหาปริมาณแบบสัมพัทธ์โดยใช้วิธี ΔΔCq ยังคงเป็นมาตรฐานสำหรับการศึกษาวิถีสัญญาณ (pathway studies), การยืนยัน Biomarker และการทดลอง Dose-response คุณวัดยีนเป้าหมายและยีนอ้างอิงที่เสถียรในเพลทเดียวกันแล้วจึงนำมาปรับค่า วิธีนี้ยอมรับความแตกต่างเล็กน้อยของปริมาณ RNA ได้หากยีนอ้างอิงเสถียรเพียงพอภายใต้สภาวะการทดลอง

การทดสอบ Copy number variation ใช้การออกแบบโพรบแบบคู่ (duplex) โดยจับคู่การทดสอบเป้าหมายกับตำแหน่งอ้างอิงในปฏิกิริยาเดียวกัน วิธีนี้ช่วยยืนยันเหตุการณ์ Genomic integration, ตรวจจับการลบยีน (gene deletions) และสนับสนุนการคัดเลือก Clone ระหว่างการพัฒนา Cell line

การตรวจจับเชื้อก่อโรคและกระบวนการทางคลินิก

qPCR แบบใช้โพรบเหมาะสมสำหรับการตรวจจับเชื้อก่อโรค เนื่องจากโพรบแบบ Dual-labelled เพิ่มความจำเพาะของลำดับเบส นอกเหนือจากการจับของไพรเมอร์ แผงการตรวจแบบ Multiplex สามารถวัดปริมาณเชื้อ, ระบุยีนดื้อยา และตรวจจับตัวควบคุมการสกัดภายในได้พร้อมกัน สิ่งนี้ช่วยลดระยะเวลาการทำงาน (turnaround time) เมื่อเทียบกับการทดสอบเดี่ยว (singleplex)

การวัดปริมาณไวรัส (viral load), การติดตามการตอบสนองต่อการรักษา และการคัดกรองการบริจาคเลือดล้วนอาศัยขั้นตอนการทำงาน qPCR ที่ได้รับการรับรอง ซึ่งความสม่ำเสมอของประสิทธิภาพระหว่างการรันเป็นสิ่งที่ยอมรับไม่ได้หากมีการเปลี่ยนแปลง

การควบคุมคุณภาพด้านอาหาร, สิ่งแวดล้อม และเภสัชกรรม

ในการทดสอบอาหาร qPCR คัดกรองเหตุการณ์ GMO ที่ได้รับการอนุมัติ, ลำดับ DNA ที่เกี่ยวข้องกับสารก่อภูมิแพ้ และจุลินทรีย์บ่งชี้ เช่น Salmonella หรือ Listeria วิธีนี้ใช้ได้กับเมทริกซ์ที่ซับซ้อนหากขั้นตอนการสกัดและทำความสะอาดถูกควบคุมอย่างดี สำหรับห้องปฏิบัติการที่ใช้ qPCR ในการทดสอบสินค้าเกษตร กระบวนการนี้ใช้หลักการเตรียมตัวอย่างเช่นเดียวกับขั้นตอนการวิเคราะห์ใน คู่มือวิธีควบคุมคุณภาพสำหรับน้ำมันพืช

ห้องปฏิบัติการสิ่งแวดล้อมใช้ qPCR เพื่อหาปริมาณยีนเชิงหน้าที่ในดินและน้ำ ติดตามกิจกรรมของจุลินทรีย์เพื่อบ่งชี้สุขภาพของระบบนิเวศ การควบคุมคุณภาพทางเภสัชกรรมใช้วิธีนี้เพื่อวัด DNA ของเซลล์เจ้าบ้านที่ตกค้างและตรวจจับสิ่งปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์ทางชีวภาพ ซึ่งทั้งสองด้านนี้มีเกณฑ์การยอมรับตามกฎระเบียบที่เข้มงวด

ในกระบวนการวิเคราะห์ที่มีการควบคุม qPCR มักถูกใช้คู่กับวิธีการยืนยันอื่นๆ การยืนยันด้วย Mass spectrometry ช่วยเพิ่มความจำเพาะทางโครงสร้างให้กับสัญญาณระดับโมเลกุลที่พบ สำหรับห้องปฏิบัติการที่จัดการเวิร์กโฟลว์แบบผสมผสาน สามารถดูบริบทที่เกี่ยวข้องเกี่ยวกับการสร้างกลยุทธ์การยืนยันแบบบูรณาการในบทความเรื่อง LC-MS innovations for drug analysis

การประยุกต์ใช้	ประเภทตัวอย่าง	เป้าหมาย	ช่วงการตรวจวัด	ชุดควบคุมหลัก	เวลาที่ใช้
Gene expression	Cell culture RNA, tissue	mRNA (cDNA)	5–6 ลำดับขั้น	NTC, no-RT, ยีนอ้างอิง	3–5 ชั่วโมง
Pathogen load	Clinical swab, serum	Viral/Bacterial DNA/RNA	4–6 ลำดับขั้น	NTC, positive control, extraction control	2–4 ชั่วโมง
GMO screening	Food commodity	Transgenic construct	3–5 ลำดับขั้น	NTC, certified reference material	4–6 ชั่วโมง
Environmental	Soil, water	Functional genes, 16S	4–6 ลำดับขั้น	NTC, inhibition control	3–5 ชั่วโมง
Pharma QC	Bioreactor harvest	Host cell DNA	5–7 ลำดับขั้น	NTC, positive control, spike recovery	4–8 ชั่วโมง

สรุปและรายการตรวจสอบขั้นถัดไป

qPCR เปลี่ยนข้อมูลฟลูออเรสเซนซ์แบบเรียลไทม์ให้เป็นคำตอบเชิงปริมาณโดยการติดตามการเพิ่มจำนวนในทุกรอบ การเลือกเคมีภัณฑ์กำหนดความจำเพาะและความสามารถในการทำ Multiplex: SYBR สำหรับเป้าหมายเดี่ยวที่ตรงไปตรงมา และโพรบเมื่อต้องการการยืนยันลำดับเบสและการทำ Multiplex ชุดควบคุมและการตรวจสอบประสิทธิภาพคือสิ่งที่แยกข้อมูลที่ตีพิมพ์ได้ออกจากสัญญาณที่คลุมเครือ

ก่อนเริ่มรันเพลทแรก ให้ตรวจสอบรายการต่อไปนี้:

ยืนยันช่องสัญญาณทางแสงของเครื่องมือและความต้องการสีย้อมอ้างอิง (passive reference)
เลือกเคมีภัณฑ์ตามความซับซ้อนของเป้าหมายและความต้องการ SNP
ตรวจสอบประสิทธิภาพของไพรเมอร์และความเป็นเส้นตรงด้วยการเจือจาง 5 หรือ 6 จุด
เตรียมชุดควบคุม: NTC, no-RT (ถ้าใช้ RNA), positive control และยีนอ้างอิงหรือกราฟมาตรฐาน
กำหนดเกณฑ์การยอมรับผลลัพธ์ (ประสิทธิภาพ 90–110%, R² ≥ 0.99, Melt curve ที่สะอาด)
บันทึกโปรโตคอลฉบับสมบูรณ์ใน SOP ก่อนมอบหมายให้เจ้าหน้าที่คนอื่นปฏิบัติ

ด้วยเคมีภัณฑ์ที่ได้รับการตรวจสอบ รีเอเจนต์ที่ถูกต้อง และชุดควบคุมที่สม่ำเสมอ qPCR จะให้ข้อมูลเชิงปริมาณที่ทำซ้ำได้ทั้งในงานวิจัยและสภาพแวดล้อม QC ที่มีกฎระเบียบควบคุม

คำถามที่พบบ่อย

จะคำนวณประสิทธิภาพการเพิ่มจำนวน qPCR ได้อย่างไร และช่วงใดที่ยอมรับได้?

ใช้ความชัน (slope) จากกราฟมาตรฐานของการเจือจางอนุกรม และใช้สูตร E = 10^(−1/slope) − 1 ประสิทธิภาพระหว่าง 90 ถึง 110 เปอร์เซ็นต์บ่งชี้ว่าปฏิกิริยาเพิ่มจำนวนผลิตผลได้อย่างน่าเชื่อถือในทุกรอบ หากผลลัพธ์อยู่นอกช่วงนี้ ให้ทบทวนการออกแบบไพรเมอร์, อุณหภูมิการจับ (annealing temp) หรือความเข้มข้นของ Mg²⁺ ก่อนตีความค่า Cq

ชุดควบคุมใดที่จำเป็นสำหรับการศึกษาการแสดงออกของ RNA ด้วย qPCR?

อย่างน้อยต้องมี NTC, no-RT control, positive control และยีนอ้างอิงที่เสถียรสำหรับการปรับมาตรฐาน no-RT control จะช่วยตรวจการปนเปื้อนของ genomic DNA ในการเตรียม RNA ของคุณ สำหรับการทดสอบด้วย SYBR การวิเคราะห์ Melt curve ช่วยยืนยันว่าตรวจพบผลิตภัณฑ์ที่จำเพาะเพียงชนิดเดียว

เมื่อใดที่ควรเลือก SYBR Green เทียบกับ qPCR แบบใช้โพรบ?

SYBR Green เหมาะสำหรับการทดสอบเป้าหมายเดียวที่ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบมาอย่างดีและ Melt curve สามารถยืนยันตัวตนของผลิตภัณฑ์ได้ เลือกเคมีภัณฑ์แบบใช้โพรบเมื่อต้องการแยกแยะลำดับเบสที่ใกล้เคียงกัน, ตรวจหา SNP หรือทำ Multiplex ต้นทุนรีเอเจนต์ที่สูงขึ้นของโพรบมักถูกชดเชยด้วยความเสี่ยงในการเกิดผลบวกปลอมที่ลดลงในเมทริกซ์ที่ซับซ้อน

จะกำหนดเกณฑ์ Cq (threshold) ให้ถูกต้องได้อย่างไร?

วางตำแหน่ง Threshold ให้อยู่ในช่วง Exponential amplification เหนือระดับสัญญาณรบกวนพื้นหลัง โดยที่จุดซ้ำของกราฟมาตรฐานแสดงความสัมพันธ์แบบเส้นตรงของ Cq กับ Log-concentration เครื่องมือจำนวนมากมีระบบคำนวณอัตโนมัติ แต่การตรวจสอบด้วยตนเองช่วยเพิ่มความสม่ำเสมอในการศึกษาหลายชุด รักษาค่า Threshold ให้คงที่สำหรับชุดการทดลองที่คุณต้องการเปรียบเทียบกันโดยตรง

ความแตกต่างระหว่าง qPCR และ Digital PCR ในการหาปริมาณคืออะไร?

qPCR ประมาณจำนวน Copy number จากค่า Cq เทียบกับกราฟมาตรฐาน ในขณะที่ Digital PCR แยกปฏิกิริยาออกเป็นช่องเล็กๆ นับพันและนับจำนวนบวกเทียบกับลบเพื่อให้ได้จำนวน Copy number จริงโดยไม่ต้องใช้กราฟมาตรฐาน Digital PCR มีข้อได้เปรียบในการตรวจหาความผันแปรที่หายากและการหาปริมาณแบบสัมบูรณ์ใกล้ขีดจำกัดการตรวจวัด สำหรับการใช้งานทั่วไป qPCR ให้ปริมาณงานที่สูงกว่าและต้นทุนต่อตัวอย่างที่ต่ำกว่า