HPLC คืออะไร?

ห้องปฏิบัติการทั่วโลกพึ่งพา high performance liquid chromatography (HPLC) ในการแยกและหาปริมาณสารในส่วนผสมที่ซับซ้อนได้อย่างแม่นยำ คู่มือนี้อธิบายว่า high performance liquid chromatography คือเทคนิคที่ทำงานอย่างไร ประกอบด้วยชิ้นส่วนใดบ้าง และการเลือกวิธีวิเคราะห์ที่ช่วยเพิ่มคุณภาพข้อมูล ใช้เป็นแนวทางสำหรับทีมงานหรือประกอบการตัดสินใจจัดซื้อให้สอดคล้องกับเป้าหมายการวิเคราะห์

High performance liquid chromatography (HPLC) คืออะไร?

High performance liquid chromatography (HPLC) คือเทคนิคการแยกสารด้วยแรงดันที่ผ่านตัวอย่างของเหลวผ่านคอลัมน์ที่บรรจุวัสดุอัดแน่น เพื่อแยกสารโดยอาศัยความแตกต่างของอันตรกิริยาระหว่างสารกับเฟสอยู่กับที่และเฟสเคลื่อนที่ที่ไหลผ่าน เครื่องตรวจวัดจะบันทึกสารแต่ละชนิดเมื่อถูกชะออกจากคอลัมน์ และแสดงผลเป็นโครมาโทแกรมของพีคที่ใช้เป็นข้อมูลสำหรับการระบุชนิดและหาปริมาณสาร

ระบบ HPLC ประกอบด้วยปั๊มตัวทำละลาย autosampler คอลัมน์วิเคราะห์ เครื่องตรวจวัด และระบบข้อมูล ภายใต้อัตราการไหลที่ควบคุม สารวิเคราะห์จะแยกออกเป็นพีคแยกต่างหาก โดยแต่ละพีคมีลักษณะเฉพาะคือเวลาการกักเก็บและพื้นที่ใต้พีคที่สามารถเปรียบเทียบกับมาตรฐานการสอบเทียบได้

HPLC เหมาะสำหรับโมเลกุลขนาดเล็กและชีวโมเลกุลในงานด้านเภสัชกรรม อาหาร สิ่งแวดล้อม และคลินิก มีความละเอียดสูงกว่า ความสามารถในการทำซ้ำดีกว่า และใช้เวลาในการรันสั้นกว่าโครมาโทกราฟีคอลัมน์เปิดแบบดั้งเดิม ทำให้เป็นเครื่องมือการแยกสารมาตรฐานในห้องปฏิบัติการวิเคราะห์ส่วนใหญ่

หลักการทำงานของ high performance liquid chromatography

การรัน HPLC เริ่มจากการฉีดตัวอย่างเข้าสู่เฟสเคลื่อนที่ที่กำลังไหล ตามด้วยการแยกสารบนคอลัมน์ที่บรรจุวัสดุอัดแน่น และการตรวจวัดพีคที่ถูกชะออก อัตราการไหล อุณหภูมิคอลัมน์ และองค์ประกอบของตัวทำละลายจะควบคุมการกักเก็บ การแยก และรูปร่างของพีค การปรับตั้งค่าวิธีวิเคราะห์จะสมดุลระหว่างการเลือกสรรกับปริมาณงานสำหรับแมทริกซ์ตัวอย่างที่กำหนด

การกักเก็บเกิดจากกลไกทางกายภาพอย่างใดอย่างหนึ่ง ได้แก่ การแบ่งส่วน การดูดซับ การแลกเปลี่ยนไอออน หรือ hydrophilic interaction ขึ้นอยู่กับโหมดที่เลือกใช้ การเข้าใจว่ากลไกใดเป็นตัวหลักในระบบของคุณคือจุดเริ่มต้นของการพัฒนาวิธีวิเคราะห์อย่างมีเหตุผล

หลักการแยกสารและโหมดต่างๆ

Reversed phase เป็นโหมด HPLC ที่ใช้กันมากที่สุด เฟสอยู่กับที่ที่ไม่มีขั้ว เช่น C18 กักเก็บสารวิเคราะห์ที่ชอบน้ำน้อยผ่าน hydrophobic interactions และการใช้ gradient จากน้ำไปยังตัวทำละลายอินทรีย์จะปรับความแรงในการชะ โหมดนี้ครอบคลุมสารเป้าหมายในงานเภสัชกรรม อาหาร และสิ่งแวดล้อมในกลุ่มโมเลกุลขนาดเล็กได้กว้างที่สุด

Normal phase ใช้เฟสอยู่กับที่ที่มีขั้วร่วมกับตัวชะที่ไม่มีขั้ว เหมาะสำหรับการแยก isomer และวิตามินที่ละลายในไขมัน Ion exchange แยกสารที่มีประจุโดยการปรับ pH และความแรงไอออนิกของเฟสเคลื่อนที่ ซึ่งเป็นแนวปฏิบัติมาตรฐานสำหรับนิวคลีโอไทด์ กรดอะมิโน และโปรตีนในรูปที่มีประจุ

HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography) กักเก็บสารวิเคราะห์ที่มีขั้วและสารไอออนิกโดยใช้ตัวทำละลายอินทรีย์ปริมาณสูงร่วมกับชั้นน้ำที่เสริมบริเวณผิวเฟสอยู่กับที่ โหมดนี้มีคุณค่าอย่างยิ่งสำหรับงาน metabolomics, polar APIs และสารที่ชะออกเร็วเกินไปบนคอลัมน์ reversed phase มาตรฐาน

ขั้นตอนการทำงานและการอ่านสัญญาณ

เตรียมและกรองตัวอย่างก่อนโหลดลงใน autosampler ปั๊มจะส่งปริมาตรที่กำหนดไปยังคอลัมน์ โดยรักษาการไหลให้คงที่ภายใต้ backpressure ของระบบขณะที่คอลัมน์ทำการแยกสาร

เครื่องตรวจวัด ซึ่งโดยทั่วไปคือ UV-Vis หรือ mass spectrometer จะบันทึกพีคเมื่อสารถูกชะออก การหาปริมาณอาศัยกราฟสอบเทียบหรือ internal standards โดยมีการตรวจสอบ system suitability เพื่อยืนยันว่าการแยกและความสมมาตรของพีคเป็นไปตามเกณฑ์ยอมรับก่อนการรันแต่ละชุด

ความบริสุทธิ์ของตัวทำละลายส่งผลโดยตรงต่อสัญญาณรบกวน baseline โดยเฉพาะในวิธีที่เชื่อมต่อกับ MS สำหรับงาน LC-MS การเลือกใช้ตัวทำละลายเกรด UHPLC-MS จะช่วยลดการเกิด adduct และ background ใน ion source ที่อาจส่งผลต่อขีดจำกัดการตรวจวัด LiChrosolv® UHPLC-MS Solvents by Supelco® ได้รับการพัฒนาสูตรเฉพาะสำหรับงานที่ต้องการความละเอียดสูงเหล่านี้ ให้ผู้ใช้ LC-MS มั่นใจในการได้ baseline ที่สะอาดและประสิทธิภาพการ ionization ที่สม่ำเสมอ

ส่วนประกอบหลักของระบบ HPLC และวัสดุที่ควรเลือกใช้

ส่วนประกอบทุกชิ้นในระบบ HPLC ล้วนมีส่วนในประสิทธิภาพโดยรวมที่สังเกตได้จากเครื่องตรวจวัด การจับคู่ข้อกำหนดของฮาร์ดแวร์ให้เหมาะสมกับความต้องการของวิธีวิเคราะห์ช่วยป้องกันปัญหาที่พบบ่อย เช่น peak broadening, carryover และความดันพุ่งสูง

ตารางด้านล่างสรุปส่วนประกอบหลักของระบบและสิ่งที่ควรพิจารณาในระหว่างการติดตั้งหรือการจัดซื้อ

การเลือกคอลัมน์และประสิทธิภาพ

คอลัมน์วิเคราะห์คือจุดที่การแยกสารเกิดขึ้นจริง ดังนั้นเคมีของเฟสอยู่กับที่จึงเป็นหนึ่งในการตัดสินใจที่สำคัญที่สุดในการพัฒนาวิธีวิเคราะห์ C18 เป็นจุดเริ่มต้นที่หลากหลายและมีเอกสารอ้างอิงมากสำหรับงาน reversed phase ในแมทริกซ์ตัวอย่างหลายประเภท Ascentis® Express C18 by Merck ให้ประสิทธิภาพ reversed phase ที่แข็งแกร่งผ่านเทคโนโลยีอนุภาค Fused-Core® ซึ่งลดระยะทางการแพร่กระจายและลดการมีส่วนร่วมของ van Deemter A-term ส่งผลโดยตรงต่อพีคที่คมชัดขึ้นและเวลารันที่สั้นลงโดยไม่เพิ่มความดันของระบบอย่างเป็นสัดส่วน

สำหรับวิธีวิเคราะห์ที่ต้องใช้เฟสเคลื่อนที่ที่มีน้ำสูง เฟส C18 มาตรฐานอาจเกิดการ dewet และสูญเสียการกักเก็บ เฟสที่ออกแบบมาเพื่อความสามารถในการเปียกและการกักเก็บแบบ polar ภายใต้สภาวะที่มีน้ำสูงจะแก้ปัญหานี้ได้โดยไม่ต้องออกแบบ gradient ใหม่ทั้งหมด คอลัมน์ Ascentis® Express AQ-C18 ได้รับการออกแบบมาสำหรับสภาวะเหล่านี้โดยเฉพาะ รักษาการกักเก็บที่เสถียรแม้ในสภาวะที่มีน้ำสูงซึ่งอาจทำให้ C18 bed แบบปกติเสียหาย

หากสารเป้าหมายต้องการความเสถียรที่ pH สูงกว่าช่วงกลาง คอลัมน์ Ascentis® Express 120 Å C18 pH+ U/HPLC Columns ขยายช่วง pH การทำงาน ซึ่งมีความเกี่ยวข้องอย่างยิ่งสำหรับสารประกอบเบสที่ต้องการ pH เฟสเคลื่อนที่สูงเพื่อให้ได้รูปร่างพีคที่ยอมรับได้ คอลัมน์ที่สั้นกว่าและอนุภาคขนาดเล็กกว่าช่วยลดรอบเวลา แต่ยังเพิ่ม backpressure ด้วย ดังนั้นควรยืนยันเสมอว่าข้อกำหนดของคอลัมน์อยู่ในช่วงความดันทำงานสูงสุดของเครื่องก่อนจัดซื้อ

เครื่องตรวจวัด ข้อมูล และระบบท่อ

UV-Vis เป็นเครื่องตรวจวัดที่เข้าถึงได้มากที่สุดสำหรับสารวิเคราะห์ที่มี chromophore Fluorescence, ELSD, CAD และ MS ขยายการครอบคลุมไปยังสารที่ไม่ดูดซับ UV หรือสารที่ไม่เสถียร ซึ่งจะมองไม่เห็นด้วยการตรวจวัดมาตรฐาน

Extra-column band broadening เป็นข้อกังวลในทางปฏิบัติใน HPLC สมัยใหม่ โดยเฉพาะเมื่อใช้อนุภาคขนาดต่ำกว่า 3 µm ควรตัดท่อเชื่อมต่อให้สั้นและจับคู่เส้นผ่านศูนย์กลางภายในให้เหมาะสมกับอัตราการไหลของระบบ guard column ที่มีเคมีเฟสอยู่กับที่เหมือนกันจะปกป้อง analytical bed จากอนุภาคและการปนเปื้อนทางเคมี ช่วยยืดอายุการใช้งานคอลัมน์ได้อย่างมีนัยสำคัญ

การเลือกเฟสเคลื่อนที่และวัสดุสิ้นเปลือง

คุณภาพของเฟสเคลื่อนที่กำหนดระดับสัญญาณรบกวนพื้นฐานของวิธี HPLC ใดก็ตาม ใช้ตัวทำละลายเกรด HPLC สำหรับวิธีที่ใช้การตรวจวัด UV และเปลี่ยนเป็นเกรด UHPLC หรือ UHPLC-MS สำหรับ mass spectrometry HPLC/UHPLC Solvents จาก TCI Chemicals ครอบคลุม organic modifiers ที่ใช้ทั่วไปในงาน reversed phase, normal phase และ HILIC ให้ความบริสุทธิ์ที่สม่ำเสมอตลอดทุกเกรดการวิเคราะห์

กรองเฟสเคลื่อนที่และตัวอย่างทั้งหมดผ่านเมมเบรนขนาด 0.2 หรือ 0.45 µm ก่อนใช้งาน เพื่อปกป้อง column frits, check valves และ injection ports ทำการ degas ตัวทำละลายอย่างทั่วถึงเพื่อป้องกันการเกิดฟองอากาศที่รบกวน baseline และความเสถียรของการไหล

การประยุกต์ใช้และกรณีที่ห้องปฏิบัติการควรเลือกใช้ HPLC

HPLC เป็นเทคนิคการแยกสารที่เหมาะสมสำหรับโมเลกุลที่ไม่ระเหยหรือสลายตัวได้ง่ายด้วยความร้อน ซึ่ง GC ไม่เหมาะสม รองรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ active pharmaceutical ingredients (APIs), สิ่งเจือปน, กรดอะมิโน, เปปไทด์, สารกำจัดศัตรูพืช, mycotoxins และวัตถุเจือปนอาหารในกรอบระเบียบข้อบังคับที่หลากหลาย

เลือก HPLC เมื่อต้องการความละเอียดสูงพร้อมเวลารันที่เหมาะสมและเครื่องตรวจวัดที่หาได้ง่าย พิจารณา UHPLC เมื่อต้องเพิ่มปริมาณงานหรือ peak capacity และเครื่องของคุณรองรับความดันทำงานที่สูงขึ้น การถ่ายโอนวิธีจากการพัฒนาไปสู่ QC ต้องใส่ใจอย่างรอบคอบในด้านความทนทาน ได้แก่ การกำหนดมาตรฐานคอลัมน์ เกรดบัฟเฟอร์ และความบริสุทธิ์ของตัวทำละลาย จากนั้นยืนยัน system suitability ด้วยตัวชี้วัด resolution และ tailing factor ก่อนเผยแพร่วิธีให้ใช้งานประจำ

การเลือกโหมดและคอลัมน์ตามประเภทตัวอย่าง

สำหรับงานเภสัชกรรมและห้องปฏิบัติการทางการแพทย์ reversed phase C18 เป็นจุดเริ่มต้นที่แข็งแกร่ง เมื่อสารเป้าหมายเป็น aromatic isomers หรือสารที่มีโครงสร้างคล้ายคลึงกันที่ co-elute บน C18 เฟส biphenyl จะให้ selectivity ที่แตกต่างผ่าน pi-pi interactions คอลัมน์ Ascentis® Express Biphenyl U/HPLC Columns ได้รับการออกแบบมาเพื่อข้อได้เปรียบด้าน selectivity นี้ ทำให้เป็นตัวเลือกเสริมที่ดีสำหรับคอลัมน์ C18 มาตรฐานในชุดเครื่องมือพัฒนาวิธีวิเคราะห์

สำหรับห้องปฏิบัติการด้านความปลอดภัยอาหารและสิ่งแวดล้อมที่จัดการกับสารปนเปื้อนและ metabolites ที่มีขั้ว HILIC สามารถปรับปรุงการกักเก็บสำหรับสารที่มองไม่เห็นบนคอลัมน์ reversed phase มาตรฐานได้อย่างมาก เฟสอยู่กับที่ HILIC แบบ zwitterionic รองรับการวิเคราะห์น้ำตาล นิวคลีโอไทด์ และ polar metabolites คอลัมน์ Ascentis® Express 160Å ZIC®-cHILIC ให้ HILIC selectivity แบบ zwitterionic ซึ่งเหมาะสำหรับแผนการวิเคราะห์สาร polar ทั้งในงานอาหารและ bioanalytical

สำหรับงาน bioanalysis และการศึกษาความเสถียร ที่สาร polar สูงถูกชะออกใกล้ void volume บน C18 แบบปกติ เฟส AQ-wettable C18 รักษาการกักเก็บภายใต้สภาวะที่มีน้ำสูงและหลีกเลี่ยงการ phase collapse ที่อาจทำลายการแยกกลางการรัน กลยุทธ์บัฟเฟอร์ยังขึ้นกับบริบท ได้แก่ เลือก HPLC Buffers ที่ระเหยได้ เช่น ammonium formate หรือ ammonium acetate สำหรับวิธี LC-MS และระบบ phosphate หรือ acetate ที่ไม่ระเหยสำหรับวิธีที่ใช้ UV เท่านั้น โดยรักษา pH ให้อยู่ในช่วงที่ผู้ผลิตคอลัมน์กำหนดเสมอ

HPLC Buffers จาก TCI Chemicals ประกอบด้วย ion-pair reagents และบัฟเฟอร์ในช่วง pH หลากหลาย ให้การควบคุม ionic strength และ pH ที่แม่นยำสำหรับวิธีที่ต้องการ การจับคู่บัฟเฟอร์ที่เหมาะสมกับวิธีที่ถูกต้องช่วยป้องกันการเสื่อมของรูปร่างพีคและยืดอายุคอลัมน์โดยรักษาสภาวะเฟสเคลื่อนที่ให้อยู่ในช่วงการทำงานที่ออกแบบไว้

HPLC ในทางปฏิบัติ: สรุปทางเทคนิคและเคล็ดลับการตั้งค่า

การเตรียมตัวอย่างที่สม่ำเสมอ ระบบท่อที่สะอาด และการเลือกคอลัมน์กับตัวทำละลายที่เข้าคู่กัน ล้วนเป็นปัจจัยที่ส่งผลต่อความแปรผันส่วนใหญ่ในประสิทธิภาพ HPLC การปรับวิธีวิเคราะห์เพียงเล็กน้อย เช่น การเปลี่ยน pH 0.1 หน่วยหรือความลาด gradient ที่ตื้นกว่า มักแก้ปัญหา tailing และ co-elution ที่ดูแก้ไขยากได้

บันทึกปริมาตรการฉีด อัตราการไหล อุณหภูมิคอลัมน์ และ system dwell volume ก่อนถ่ายโอนวิธีระหว่างเครื่อง ตรวจสอบความจำเพาะ ความเป็นเชิงเส้น ความแม่นยำ และความทนทานก่อนเผยแพร่วิธีให้ใช้งานประจำ พารามิเตอร์เหล่านี้รับประกันว่าสิ่งที่ใช้งานได้บนระบบหนึ่งจะทำซ้ำได้บนระบบอื่น

ตารางด้านล่างแสดงภาพรวมอ้างอิงของพารามิเตอร์การทำงาน HPLC ทั่วไป เพื่อเป็นแนวทางในการตั้งค่าวิธีวิเคราะห์เบื้องต้นและการแก้ปัญหา

High performance liquid chromatography (HPLC) เชื่อมโยงการเลือกใช้เคมีที่เหมาะสมกับการหาปริมาณที่เชื่อถือได้ เมื่อคุณจับคู่เคมีคอลัมน์ ความบริสุทธิ์ของตัวทำละลาย การเลือกบัฟเฟอร์ และการตั้งค่าเครื่องให้สอดคล้องกับคุณสมบัติทางกายภาพของสารเป้าหมาย ผลลัพธ์คือวิธีวิเคราะห์ที่ทำงานได้อย่างสม่ำเสมอในทุกผู้ปฏิบัติงาน ทุกเครื่อง และตลอดเวลา

สรุป

HPLC ให้การแยกสารที่แข็งแกร่งและมีความละเอียดสูงสำหรับสารวิเคราะห์หลากหลายชนิด เมื่อคอลัมน์ เฟสเคลื่อนที่ และการตั้งค่าเครื่องสอดคล้องกับสารเป้าหมาย การสร้างวิธีวิเคราะห์บนพื้นฐานของตัวทำละลายที่มีความบริสุทธิ์สูง บัฟเฟอร์ที่เลือกอย่างเหมาะสม และเคมีเฟสอยู่กับที่ที่ได้รับการพิสูจน์แล้ว จะรับประกันการกักเก็บที่ทำซ้ำได้และรูปร่างพีคที่คมชัดตลอดอายุการใช้งานของวิธี ไม่ว่าเป้าหมายของคุณจะเป็นการ profile สิ่งเจือปนในเภสัชกรรม การคัดกรองสารปนเปื้อนในอาหาร หรือการหาปริมาณใน bioanalytical พื้นฐานของ high performance liquid chromatography (HPLC) ยังคงใช้ได้อย่างสม่ำเสมอ ได้แก่ เข้าใจสารวิเคราะห์ของคุณ เลือกเคมีที่เหมาะสม และควบคุมสภาวะการทดลอง

คำถามที่พบบ่อย