วิธีเลือก Cell Lysis Buffer: RIPA, NP-40, IP Lysis และ Native Buffer
ความล้มเหลวในการทำ Co-IP ที่ไม่สามารถดึงโปรตีนเป้าหมายออกมาได้, การตรวจวิเคราะห์ phospho-blot ที่ให้สัญญาณต่ำ, หรือโปรตีนกลุ่ม membrane ที่ยังคงติดอยู่ในส่วนตะกอน (pellet): ปัญหาเหล่านี้มักมีต้นตอจากการตัดสินใจเลือกบัฟเฟอร์ก่อนเริ่มการทดลอง หากเลือกใช้ lysis buffer ไม่เหมาะสม อาจทำให้สารเชิงซ้อน (complex) ที่ต้องการสูญเสียไปหรือโปรตีนเป้าหมายไม่ละลาย สำหรับท่านที่กำลังมองหา lysis buffer ราคาเหมาะสมและมีคุณภาพ คู่มือการเลือก cell lysis buffer selection guide ฉบับนี้จะช่วยให้ท่านจับคู่การใช้งานระหว่าง RIPA, NP-40, IP lysis และ native buffer ให้สอดคล้องกับโปรตีน ประเภทของตัวอย่าง และวิธีวิเคราะห์ปลายทาง เพื่อให้ได้ lysate ที่สะอาดและพร้อมใช้งานตั้งแต่ครั้งแรก
เหตุผลที่การเลือกบัฟเฟอร์ส่งผลต่อปริมาณและกิจกรรมของโปรตีน
ระดับความรุนแรง (stringency) ของบัฟเฟอร์เป็นตัวกำหนดสิ่งที่ท่านจะสกัดออกมาจากเซลล์ สารซักฟอกกลุ่มไอออนิก (ionic detergents) เช่น SDS สามารถทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ได้อย่างรุนแรงและช่วยให้โปรตีนเกือบทุกชนิดละลายออกมาได้ รวมถึงโปรตีนกลุ่ม membrane ที่ไม่ละลายน้ำ ส่วนสารซักฟอกกลุ่มนอนไอออนิก (nonionic detergents) เช่น NP-40 หรือ Triton X-100 จะทำหน้าที่ทำให้เยื่อหุ้มเซลล์เกิดรูพรุนในขณะที่ยังรักษาอันตรกิริยาระหว่างโปรตีน (protein-protein interactions) ส่วนใหญ่เอาไว้ได้
ความเข้มข้นของเกลือและค่า pH ก็มีความสำคัญเช่นกัน โดย NaCl ที่สูงขึ้นจะช่วยลดการจับแบบไม่จำเพาะ (non-specific binding) แต่อาจทำให้ปฏิกิริยาที่ท่านต้องการจับอ่อนแรงลง การเปลี่ยนค่า pH ให้อยู่ในช่วงนอกเหนือจาก 7.4 ถึง 7.6 จะทำให้เอนไซม์และ epitopes ที่ไวต่อ PTM สูญเสียความเสถียร
ควรเลือกบัฟเฟอร์ให้ตรงกับวิธีวิเคราะห์ปลายทาง (readout) ไม่ใช่แค่ดูที่โปรตีนเป้าหมายเพียงอย่างเดียว การทำ Western blot สามารถใช้สารซักฟอกที่มีความเข้มข้นสูงได้เนื่องจากโปรตีนจะถูกทำให้เสียสภาพ (denature) อยู่แล้ว ในขณะที่การทำ Co-IP และการทดสอบกิจกรรมของเอนไซม์ต้องการสภาวะที่อ่อนโยนกว่าเพื่อรักษารูปร่างและโครงสร้างสารเชิงซ้อน ส่วนงานวิเคราะห์ด้วย Mass spectrometry จะเหมาะสมกับบัฟเฟอร์ที่ใช้สารซักฟอกน้อยที่สุดหรือสามารถกำจัดออกได้ง่ายเพื่อรักษาความสะอาดของเครื่องมือและคุณภาพข้อมูล หากท่านกำลังทำงานในสายงาน protein biology ที่มีหลายขั้นตอนวิเคราะห์ แนะนำให้ลองทดสอบ lysis buffer ราคาประหยัดในระดับนำร่องด้วยค่าความรุนแรงสองระดับก่อนที่จะเริ่มใช้ตัวอย่างทั้งหมด
สิ่งที่ท่านต้องเตรียม: บัฟเฟอร์, สารซักฟอก และสารยับยั้ง
อุปกรณ์
ท่านต้องมีถังน้ำแข็ง, ปิเปตที่ผ่านการสอบเทียบแล้ว, เครื่องปั่นเหวี่ยงไมโครเซนทริฟิวจ์ที่ทำความเย็นได้ถึง 4°C, และเครื่องเขย่าหลอดทดลอง (tube rotator) สำหรับเนื้อเยื่อหรือตะกอนที่หนาแน่น ควรเตรียมเครื่องบดเนื้อเยื่อ (homogenizer) หรือแท่งแก้วบดขนาดเล็ก นอกจากนี้ต้องมีเครื่องวัด pH ที่สอบเทียบแล้วเพื่อเตรียมบัฟเฟอร์
สารเคมีและวัสดุสิ้นเปลือง
ส่วนประกอบหลักของบัฟเฟอร์ประกอบด้วย Tris หรือ HEPES, NaCl, MgCl₂, และ glycerol ซึ่งควรเป็นเกลือเกรดชีวภาพที่มีความบริสุทธิ์สูง โดยกลุ่มสินค้า Biological Buffers ของ Merck มี Tris และ HEPES ที่ผ่านการตรวจสอบความไวต่อการเปลี่ยนแปลง pH ที่ 4°C ซึ่งมีความสำคัญอย่างยิ่งเมื่อท่านต้องปรับค่า pH ขณะบัฟเฟอร์เย็น
การเลือกสารซักฟอกเป็นตัวกำหนดระดับความรุนแรง หมวดหมู่ Detergents ของ Merck ครอบคลุมทั้ง NP-40, Triton X-100, sodium deoxycholate และ SDS ในเกรดที่เหมาะสมสำหรับการไลซิส สำหรับความต้องการสารลดแรงตึงผิวชนิดนอนไอออนิก สารจาก TCI เกรดชีวภาพ อาทิ n-Octyl β-D-Glucopyranoside (TCI O0355), n-Dodecyl-β-D-maltoside (TCI D6066) และกลุ่ม alkyl glucosides เป็นทางเลือกที่เหมาะสมสำหรับการสกัดโปรตีนอย่างอ่อนโยน
นอกจากนี้ Merck ยังมี Whole Cell Lysis Reagents and Enhancers ซึ่งเป็นสารละลายพร้อมใช้และสารช่วยลดความหนืดโดยไม่เติมกรดนิวคลีอิกปนเปื้อนลงใน lysate สุดท้าย สำหรับงาน protein sample preparation ในขั้นตอนถัดไป อย่าลืมเตรียมสารทดสอบปริมาณโปรตีนและหลอดไมโครทิวบ์ที่โปรตีนจับตัวน้อย (low-protein-binding)
กำหนดโปรตีนเป้าหมายและชนิดตัวอย่างของท่าน
ก่อนเลือกบัฟเฟอร์ ให้ตอบคำถาม 3 ข้อ: โปรตีนอยู่ที่ไหน? ท่านต้องการรักษาอันตรกิริยาหรือการปรับแต่งใด? และชนิดตัวอย่างของท่านคืออะไร?
โปรตีนในไซโทซอลมักสกัดได้ดีในบัฟเฟอร์ที่มีความรุนแรงต่ำถึงปานกลาง ส่วนโปรตีนที่ยึดเกาะกับเมมเบรน, GPCRs และโปรตีนที่ผ่านเมมเบรนหลายรอบ ต้องการสารซักฟอกชนิดนอนไอออนิกที่แรงกว่าหรือเสริมสารอื่นเพิ่ม ส่วนโปรตีนในนิวเคลียสบางครั้งจำเป็นต้องใช้การคลื่นเสียงความถี่สูง (sonication) หรือการใช้เอนไซม์นิวคลีเอสร่วมด้วย
Post-translational modifications (PTMs) มีความไวต่อเวลาอย่างมาก โดยการฟอสโฟรีเลชันและยูบิควิติเลชันจะเริ่มย้อนกลับภายในไม่กี่วินาทีหลังจากเซลล์แตก ท่านต้องระบุให้ชัดเจนว่าวิธีของท่านขึ้นอยู่กับ PTM ใด และตรวจสอบว่าสารยับยั้งที่ใช้ครอบคลุมฟอสฟาเตส, โปรตีเอส และเอนไซม์ deubiquitylases ที่เกี่ยวข้อง การเลือกสารซักฟอกที่ถูกต้องจากกลุ่ม Detergents ของ Merck ตั้งแต่ต้นจะช่วยป้องกันการต้องปรับสูตรกลางคัน
ตัวอย่างเมทริกซ์ยังมีผลต่อการเลือกบัฟเฟอร์ ตะกอนแบคทีเรียและเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมในรูปสารแขวนลอยไลซิสได้ง่ายด้วยบัฟเฟอร์มาตรฐาน ชิ้นเนื้อเยื่อที่มีส่วนประกอบของ extracellular matrix มักต้องผ่านการทำให้แตกด้วยวิธีทางกลก่อนแล้วค่อยทำเคมีไลซิส ส่วนเนื้อเยื่อที่มีเส้นใยหนาแน่นอาจต้องใช้การบดก่อนสัมผัสกับสารซักฟอก
Cell lysis buffer selection guide สำหรับ RIPA, NP-40, IP และ Native Buffers
ใช้ cell lysis buffer selection guide นี้เพื่อเลือกสูตรให้เหมาะกับบริบทการทดลองของท่าน ตารางด้านล่างสรุปองค์ประกอบ ระดับความรุนแรง และการใช้งานหลักไว้ให้แล้ว
| ประเภทบัฟเฟอร์ | องค์ประกอบทั่วไป | ความรุนแรง | เหมาะสำหรับ | ควรหลีกเลี่ยงเมื่อ |
|---|---|---|---|---|
| RIPA | 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40 หรือ Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS | สูง | สกัดโปรตีนรวม, โปรตีนเมมเบรน, Western blot | Co-IP, ทดสอบกิจกรรมเอนไซม์แบบ native, การรักษาสารเชิงซ้อน |
| NP-40 Buffer | 50 mM Tris หรือ HEPES pH 7.4–7.5, 150 mM NaCl, 0.5–1% NP-40 | ปานกลาง | โปรตีนไซโทซอลและโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเมมเบรน, WB ที่ต้องการรักษา epitope | สารเชิงซ้อนที่เปราะบาง, Native MS |
| IP Lysis Buffer | 20–50 mM Tris หรือ HEPES pH 7.4–7.5, 150 mM NaCl, 0.1–0.5% nonionic detergent, 10% glycerol | อ่อนโยน | Co-immunoprecipitation, การดึงสารเชิงซ้อน, การศึกษาอันตรกิริยา | โปรตีนเมมเบรนที่ไม่ละลายน้ำ, การหาโปรไฟล์โปรตีนรวม |
| Native Buffer | 20–50 mM HEPES หรือ Tris pH 7.4–8.0, 50–150 mM NaCl, 1–5 mM MgCl₂, 5–10% glycerol; มีสารซักฟอกน้อยมากหรือไม่มีเลย | ต่ำสุด | ทดสอบกิจกรรมเอนไซม์, Native PAGE, Native mass spectrometry | โปรตีนเมมเบรน, การสกัดโปรตีนปริมาณมาก |
หากผลลัพธ์หลักคือฟอสโฟรีเลชัน ให้เติมสารยับยั้งฟอสฟาเตสลงในบัฟเฟอร์ทุกชนิดที่ท่านเลือกและทำงานบนน้ำแข็งอย่างเคร่งครัด สำหรับ GPCRs หรือโปรตีนที่ผ่านเมมเบรนหลายรอบ ให้ทดลองเสริมสาร cholate 0.5% ลงในบัฟเฟอร์ที่มีสารซักฟอกนอนไอออนิกโดยไม่ต้องใส่ SDS ทั้งนี้กลุ่ม Biological Buffers และ Detergents ของ Merck มีส่วนประกอบหลักที่จำเป็นในการปรับสูตรเหล่านี้ให้พร้อมใช้งาน
บัฟเฟอร์ไหนเหมาะกับการทดลองของท่าน?
- ต้องการผล Western blot
- ต้องการสกัดโปรตีนจากเมมเบรนให้ได้สูงสุด
- ต้องการทำ profiling โปรตีนเป้าหมายจำนวนมาก
- ต้องการรักษา Epitope แต่ไม่เน้นความสมบูรณ์ของสารเชิงซ้อน
- วางแผนทำ Co-IP หรือ proximity ligation
- กำลังวัดจลนศาสตร์หรือกิจกรรมของเอนไซม์
- ผลลัพธ์คือ Native mass spectrometry หรือ Native PAGE
- ต้องการรักษาสารเชิงซ้อนหลายหน่วยที่เปราะบางไว้ให้สมบูรณ์
สำหรับข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับตัวเลือกด้าน protein sample preparation ที่ส่งเสริมขั้นตอนการไลซิสของท่าน สามารถดูผลิตภัณฑ์หมวดหมู่เต็มได้ที่หน้าเว็บไซต์ รวมถึงอุปกรณ์ทำความสะอาดและทำให้เข้มข้น
การเตรียมบัฟเฟอร์, การไลซิสเซลล์ และการทำ lysate ให้ใส
การเตรียมและปรับสมดุลบัฟเฟอร์
- เตรียม working buffer 10 mL ต่อเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม 1 ถึง 2 × 10⁷ เซลล์ หรือต่อเนื้อเยื่อ 100 mg ปรับสัดส่วนตามตัวอย่างที่ใหญ่ขึ้น
- ปรับค่า pH ให้อยู่ระหว่าง 7.4 ถึง 7.5 ด้วยเครื่องวัด pH ที่สอบเทียบแล้วในขณะที่บัฟเฟอร์เย็นที่ 4°C โปรดทราบว่าค่า pH ของ Tris จะเปลี่ยนไปตามอุณหภูมิ ดังนั้นควรวัดขณะเย็นเสมอ
- เติมสารซักฟอกให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายที่ต้องการ: 0.5 ถึง 1% NP-40 สำหรับ NP-40 buffer, 1% NP-40 บวก 0.5% deoxycholate บวก 0.1% SDS สำหรับ RIPA, 0.1 ถึง 0.5% nonionic detergent สำหรับ IP buffer หรือไม่ต้องเติมสารซักฟอกสำหรับ native buffer
- เติม 10% glycerol หากกำลังเตรียม IP lysis หรือ native buffer เพื่อช่วยให้สารเชิงซ้อนโปรตีนมีความเสถียร
- เติม 1 ถึง 5 mM MgCl₂ หากต้องการใช้เอนไซม์นิวคลีเอสลดความหนืด
- เติมสารยับยั้งโปรตีเอสและฟอสฟาเตสก่อนใช้งานทันที ห้ามผสมทิ้งไว้ใน stock buffer
- แช่บัฟเฟอร์และหลอดทดลองทั้งหมดในน้ำแข็งล่วงหน้าอย่างน้อย 10 นาที หรือเลือกกรองผ่านเมมเบรน 0.22 µm เพื่อกำจัดอนุภาคออก
การไลซิส, การตัดสาย DNA และการทำใหใส
- เก็บเซลล์ด้วยการปั่นเหวี่ยงและล้างตะกอนด้วย PBS เย็น 1 ครั้ง กำจัด PBS ออกให้หมดก่อนเติม lysis buffer
- แขวนตะกอนเซลล์ใน lysis buffer ปริมาตร 5 ถึง 10 เท่าของขนาดตะกอน
- บ่มบนน้ำแข็ง 10 ถึง 20 นาทีพร้อมเขย่าเบาๆ หลีกเลี่ยงการใช้ vortex เพราะจะทำให้เกิดฟอง
- ตัดสาย DNA (shear) โดยการดูด lysate ผ่านเข็มขนาด 21G จำนวน 5 ถึง 10 ครั้งอย่างช้าๆ หรือเติมเอนไซม์นิวคลีเอสตามคำแนะนำแล้วบ่มบนน้ำแข็ง 5 นาที
- ปั่นเหวี่ยงที่ 12,000 ถึง 20,000 × g เป็นเวลา 10 ถึง 15 นาทีที่ 4°C เพื่อแยกนิวเคลียส, เศษเซลล์ และสารที่ไม่ละลายน้ำออก
- ย้ายส่วนใส (clarified lysate) ลงในหลอดใหม่ที่แช่เย็นไว้ ระวังอย่าไปโดนส่วนตะกอน
- วัดปริมาณโปรตีนด้วยวิธี BCA หรือ Bradford จากนั้นทำ normalized แล้วดำเนินการต่อด้วย SDS-PAGE, Western blot, IP หรือกิจกรรม assay ได้ทันที
ผลิตภัณฑ์ Whole Cell Lysis Reagents and Enhancers ของ Merck มีสารช่วยไลซิสและสารเติมแต่งนิวคลีเอสสำเร็จรูปที่ช่วยลดความหนืดได้อย่างดีเยี่ยม สำหรับผลิตภัณฑ์ Protein Sample Prep ของ Merck จะครอบคลุมถึงขั้นตอน downstream cleanup รวมถึงคอลัมน์กำจัดสารซักฟอกในกรณีที่งานวิเคราะห์ MS ต้องการตัวอย่างที่ปราศจากสารซักฟอก
เคล็ดลับและข้อควรระวังสำหรับการไลซิสที่ได้ผลซ้ำได้
เคล็ดลับสำหรับการทดลองที่แม่นยำ
- ควบคุมอุณหภูมิทุกขั้นตอนที่ 0 ถึง 4°C ตั้งแต่เริ่มเก็บจนถึงขั้นตอนทำ lysate ให้ใส เพราะการปล่อยให้ร้อนเพียงครั้งเดียวอาจทำให้สูญเสีย phospho-signal
- เติมสารยับยั้งใหม่ใน working buffer ทุกครั้ง ห้ามผสมใน stock bottle
- ทดสอบความรุนแรงของสารซักฟอกสองระดับ (เช่น NP-40 และ RIPA) ควบคู่กันในปริมาณน้อยก่อนเริ่มงานจริง
- หลีกเลี่ยงการเกิดฟองระหว่างผสม เพราะฟองจะทำให้โปรตีนบนพื้นผิวเสียสภาพ
- ทำ Normalize ตามปริมาณโปรตีน ไม่ใช่จำนวนเซลล์หรือปริมาตร
- ทำ Pre-clear lysate ที่ 4°C เป็นเวลา 10 นาทีด้วยโปรตีน A/G beads ก่อนทำ IP เพื่อลดการจับแบบไม่จำเพาะ
- บันทึกเลข lot บัฟเฟอร์, ค่า pH, และเลข lot สารยับยั้งในทุกการทดลองเพื่อช่วยในการแก้ไขปัญหา
- เก็บ base buffer ไว้ที่ 4°C ได้นานถึง 4 สัปดาห์หากผ่านการกรองฆ่าเชื้อแล้ว
- เก็บสารยับยั้งที่ -20°C หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำ
สำหรับเป้าหมายที่ไม่ละลายน้ำ ให้ค่อยๆ เพิ่มความรุนแรง: เริ่มจาก native buffer แล้วค่อยขยับไปที่ NP-40 buffer และลองใช้ RIPA เป็นลำดับสุดท้าย หากโปรตีนยังคงติดอยู่กับตะกอนแม้ใช้ RIPA อาจมีการรวมตัวเป็นก้อน (aggregation) ในกรณีนี้ควรใช้วิธีการ solubilization and refolding approaches for insoluble proteins เพื่อกู้คืนกิจกรรมของโปรตีน
สำหรับงาน Mass spectrometry ควรลดการใช้สารซักฟอกให้เหลือน้อยที่สุดตั้งแต่เริ่มต้น หากเลี่ยงไม่ได้ ให้ใช้สารลดแรงตึงผิวที่กำจัดออกได้หรือเพิ่มขั้นตอน detergent-depletion ระหว่างการเตรียมตัวอย่างเพื่อป้องกันปัญหา ion suppression
การแก้ไขปัญหาการไลซิสที่พบบ่อย
| ปัญหา | สาเหตุที่คาดว่าจะเป็น | วิธีแก้ไข |
|---|---|---|
| ได้ปริมาณโปรตีนรวมต่ำ | บัฟเฟอร์อ่อนเกินไป; ระยะเวลาไลซิสไม่พอ หรือแรงทางกลไม่ถึง | เพิ่มความรุนแรง (เปลี่ยนจาก NP-40 เป็น RIPA); เพิ่มเวลาบ่ม; ใช้ sonication เพิ่มเติมสำหรับโปรตีนนิวเคลียส |
| โปรตีนย่อยสลายหรือสูญเสีย PTM | เติมสารยับยั้งช้าเกินไป หรือลืมเติม; ตัวอย่างอุ่นเกิน 4°C | เติมสารยับยั้งก่อนไลซิสทันที; ทำทุกขั้นตอนบนน้ำแข็ง; ลดเวลาไลซิสให้น้อยที่สุด |
| ความหนืดสูง ปิเปตลำบาก | DNA ในจีโนมไม่ได้ถูกตัด; เอนไซม์นิวคลีเอสไม่ทำงาน | ผ่านเข็ม 21G เพิ่ม 5–10 ครั้ง; เติมนิวคลีเอสพร้อม MgCl₂ 1–5 mM แล้วบ่ม 5 นาที; ปั่นเหวี่ยงซ้ำเพื่อแยกตะกอน |
| โปรตีนเป้าหมายติดอยู่ในตะกอน | บัฟเฟอร์อ่อนเกินไปที่จะดึงโปรตีนเมมเบรนออกมา | เปลี่ยนไปใช้ RIPA หรือเติม 0.5% deoxycholate; หากเป็นก้อนที่ละลายยากจริงๆ ให้ปรึกษาโปรโตคอลการละลายด้วยผลิตภัณฑ์ protein sample prep |
| ประสิทธิภาพ IP ต่ำ | สารซักฟอกแรงเกินไป; สารเชิงซ้อนแตกตัว; ไม่ได้ทำ Pre-clear | ใช้ IP lysis buffer ที่มีสารซักฟอกนอนไอออนิก 0.1–0.3%; เลี่ยง SDS; ทำ pre-clear lysate ก่อนเติมแอนติบอดี |
| สารซักฟอกรบกวนการวิเคราะห์ | ความเข้มข้นสารซักฟอกสูงเกินไป หรือผิดประเภทสำหรับวิธีที่เลือก | ลดความเข้มข้นสารซักฟอกให้เหลือน้อยที่สุด; ใช้ชุดตรวจวัดที่รองรับสารซักฟอก; กำจัดสารซักฟอกออกก่อน MS หรือ enzyme assay |
คำถามที่พบบ่อย
ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค
ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express
เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ Lysis Buffer จาก Merck, TCI และ MedChemExpress (MCE) และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE
Thai 
English