วิธีทำ Size Exclusion Chromatography (SEC): โปรโตคอลทำบริสุทธิ์โปรตีน

พีก (Peak) ที่กว้างและเกิดอาการหางลาก (tailing) รวมถึงการกู้คืนสาร (recovery) ที่ต่ำ มักมีสาเหตุมาจากความผิดพลาดสองประการที่หลีกเลี่ยงได้ ได้แก่ การโหลดคอลัมน์เกินขนาด และการเลือกใช้บัฟเฟอร์ตัวอย่างที่ไม่เข้ากับเฟสเคลื่อนที่ (mobile phase) ปัญหาเหล่านี้ทำให้เสียโปรตีนที่ผ่านการบริสุทธิ์ไปโดยเปล่าประโยชน์ และยังลดความชัดเจนในการแยก aggregate ออกจากโมโนเมอร์ที่จำเป็นสำหรับงานวิเคราะห์ขั้นต่อไป คู่มือนี้จะนำคุณไปสู่ทุกขั้นตอนของ workflow ในการทำ SEC protein purification ตั้งแต่การปรับสมดุลคอลัมน์ไปจนถึงการรวม fraction เพื่อให้ได้ fraction ที่สะอาดและมีความละเอียดสูง พร้อมสำหรับการวิเคราะห์หรือการใช้งานในขั้นตอนถัดไป

ทำไมและเมื่อไหร่ควรใช้ Size Exclusion Chromatography (SEC) ในงานวิเคราะห์โปรตีน

SEC ทำการแยกโปรตีนตามรัศมีไฮโดรไดนามิก (hydrodynamic radius) โดยไม่มีการจับกันของสาร ซึ่งถือเป็นทางเลือกที่เหมาะสมเมื่อคุณต้องการแยกโมโนเมอร์ออกจากไดเมอร์หรือ aggregate ขนาดใหญ่กว่า รวมถึงการกำจัดสิ่งเจือปนที่เกี่ยวข้องในกระบวนการผลิต หรือการทำสารตัวอย่างให้บริสุทธิ์ยิ่งขึ้น (polishing) หลังจากผ่านขั้นตอน affinity หรือ ion exchange มาแล้ว

เนื่องจากเฟสเคลื่อนที่ (mobile phase) เป็นเพียงตัวกลางในการทำปฏิกิริยาเดียว SEC จึงมีประสิทธิภาพสูงในการเปลี่ยนบัฟเฟอร์ (buffer exchange) และกำจัดเกลือ (desalting) เมื่อต้องการรักษาสภาพโครงสร้างดั้งเดิม (native conformation) และกิจกรรมทางชีวภาพของโปรตีนเอาไว้ โดยไม่มีขั้นตอนการชะแบบไล่ระดับ (elution gradient), ไม่มีความเครียดจาก pH, และไม่มีการแย่งกันจับของลิแกนด์

คุณควรวางแผนทำ SEC เมื่อโปรตีนเป้าหมายของคุณอยู่ในช่วงการแยก (fractionation range) ของคอลัมน์ที่คุณมี โดยยืนยันตำแหน่งการแยกได้จากการรันสารมาตรฐานน้ำหนักโมเลกุลโปรตีนและพล็อตกราฟ elution volume เทียบกับ log ของน้ำหนักโมเลกุล ซึ่งจะช่วยยืนยันว่าโปรตีนเป้าหมายของคุณแยกตัวออกมาหลังผ่าน void volume ไปแล้ว แต่ยังอยู่ก่อนถึง total permeation ทำให้คุณมีพื้นที่ในการแยก (separation space) ที่ใช้งานได้จริง สำหรับมุมมองที่กว้างขึ้นเกี่ยวกับกลไกการแยกตามขนาดทั้งในรูปแบบ gel filtration และ gel permeation สามารถดูได้ที่ คู่มือการแยกตามขนาดด้วยวิธี gel permeation และ gel filtration

อุปกรณ์ บัฟเฟอร์ และวัสดุสิ้นเปลืองที่จำเป็น

เครื่องมือและฮาร์ดแวร์คอลัมน์

คุณต้องใช้ระบบ FPLC หรือ HPLC ที่มีเครื่องตรวจวัด UV ตั้งค่าไว้ที่ 280 nm, เครื่องเก็บ fraction (fraction collector) และระบบควบคุมอุณหภูมิคอลัมน์ที่ 4 ถึง 10°C ควรเลือกคอลัมน์ SEC ที่เหมาะสมกับช่วงขนาดเป้าหมายของคุณ และลดปริมาณ dead volume ในสายท่อและข้อต่อทั้งหมดเพื่อให้คงรูปพีก (peak shape) ที่สมบูรณ์

เฟสเคลื่อนที่ (mobile phase) และน้ำยา

บัฟเฟอร์มาตรฐานที่ใช้คือ 20 mM sodium phosphate ร่วมกับ 150 mM NaCl ที่ pH 7.0 ถึง 7.5 เติม 0.02% sodium azide เฉพาะสำหรับการเก็บรักษาคอลัมน์เท่านั้น ห้ามใช้ในการรันจริงหากต้องนำโปรตีนไปทำ bioassay ต่อไป ควรกรองบัฟเฟอร์ทั้งหมดผ่านเมมเบรน 0.22 µm และไล่ฟองอากาศ (degas) ให้ละเอียดก่อนใช้งาน

วัสดุสิ้นเปลืองและสารมาตรฐานสำหรับการสอบเทียบ (Calibration)

เตรียมเครื่องมือให้พร้อมด้วย syringe filter ขนาด 0.22 µm, หลอด microcentrifuge ชนิด low-protein-binding, ขวด HPLC vial ชนิด low-protein-binding และไซริงค์สำหรับโหลดตัวอย่างแบบแมนนวล สำหรับการทำ calibration ให้เตรียม Blue Dextran (สำหรับวัด void volume) และชุดสารมาตรฐานน้ำหนักโมเลกุลโปรตีน เช่น thyroglobulin, gamma globulin, ovalbumin, myoglobin และ vitamin B12

สำหรับการเตรียมตัวอย่างก่อนฉีดเข้าเครื่อง กลุ่มผลิตภัณฑ์ Protein Sample Prep จาก Merck ครอบคลุมถึงเครื่องมือเข้มข้นตัวอย่าง (centrifugal concentrator) และอุปกรณ์กรองที่ช่วยกำจัดอนุภาคและปรับความเข้มข้นโปรตีนโดยไม่ทำให้เกิดสิ่งเจือปนที่ส่งผลต่อประสิทธิภาพคอลัมน์ คุณสามารถเข้าถึงกลุ่มผลิตภัณฑ์ Protein Biology ทั้งหมดสำหรับเครื่องมือช่วยเข้มข้น ทำความสะอาด และวิเคราะห์ขั้นตอนหลังการทำ SEC ได้

การเตรียมและการปรับสมดุล (Equilibration) คอลัมน์ SEC

การคำนวณปริมาตรคอลัมน์ (Column Volume) และการตั้งค่าอัตราการไหล (Flow Rate)

คำนวณปริมาตรคอลัมน์ (CV) จากขนาดของคอลัมน์ สำหรับคอลัมน์ขนาด 10 × 300 mm จะมี CV ประมาณ 23 mL ปริมาตรการปรับสมดุล ขีดจำกัดการโหลดตัวอย่าง และขนาดของ fraction ทั้งหมดจะอ้างอิงจากตัวเลขนี้ ไม่ใช่เวลาที่ใช้ในการรัน

ตั้งค่าอัตราการไหลให้อยู่ในช่วงที่ผู้ผลิตแนะนำ สำหรับคอลัมน์ HPLC SEC ขนาด 10 × 300 mm อัตราการไหล 0.2 ถึง 1.0 mL/min ถือเป็นเรื่องปกติ สำหรับคอลัมน์ agarose แบบ gravity-fed ควรอยู่ที่ 0.5 ถึง 1.0 CV ต่อชั่วโมง และพยายามรักษาความดันของระบบให้ต่ำกว่าค่าสูงสุดที่คอลัมน์รับได้ที่ 10 ถึง 20% เสมอ

ขั้นตอนการปรับสมดุล (Equilibration)

1. ล้างคอลัมน์ด้วยน้ำ ultrapure ประมาณ 2 ถึง 3 CV เพื่อไล่สารกันเสียที่ใช้ในการจัดเก็บ (ปกติคือ 20% ethanol)
2. เปลี่ยนไปใช้บัฟเฟอร์ที่ใช้งาน (running buffer) และรันผ่านคอลัมน์ 5 CV ที่อัตราการไหลและอุณหภูมิที่กำหนด จนกว่าเส้น baseline ของ UV จะเรียบและคงที่
3. ฉีด Blue Dextran ปริมาตร 0.2 ถึง 0.5 mL และบันทึกปริมาตรที่ชะออกมาเป็น Vo ซึ่งปริมาตรตายตัว (void volume) นี้จะเป็นฐานในการตัดสินใจรวม fraction ในขั้นตอนถัดไป
4. หากมีการนำคอลัมน์กลับมาใช้ซ้ำ ให้ล้างด้วยบัฟเฟอร์ความเข้มข้นเกลือสูง (เช่น 1 M NaCl) จำนวน 2 CV ตามด้วยน้ำ 1 CV และปรับสมดุลอีกครั้งด้วย running buffer จำนวน 3 ถึง 5 CV ก่อนฉีดตัวอย่างใหม่

ตารางอ้างอิงรูปแบบคอลัมน์

การเตรียมและตรวจสอบตัวอย่างโปรตีนสำหรับ SEC

การทำให้ใสและการกรอง

อนุภาคเป็นตัวการที่ทำให้คอลัมน์ SEC เสียหายได้เร็วที่สุด ควรปั่นเหวี่ยงตัวอย่างที่ 10,000 × g นาน 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4°C จากนั้นกรองผ่าน syringe filter ชนิด low-protein-binding ขนาด 0.22 µm ทันทีก่อนฉีดเข้าคอลัมน์ ห้ามข้ามขั้นตอนการกรองแม้ตัวอย่างจะดูใสก็ตาม

1. ย้ายตัวอย่างลงในหลอด microcentrifuge ที่แช่เย็นไว้
2. ปั่นเหวี่ยงที่ 10,000 × g นาน 10 นาที ที่ 4°C
3. ใช้ปิเปตต์ดูดเฉพาะส่วนใส (supernatant) ระวังอย่าให้โดนตะกอน
4. กรองผ่านเมมเบรน 0.22 µm ลงในขวด vial ชนิด low-protein-binding

การปรับบัฟเฟอร์และเข้มข้นตัวอย่าง

การใช้บัฟเฟอร์ตัวอย่างที่ไม่เข้ากันจะสร้าง refractive index artifact ขณะฉีดและทำให้เกิดพีก (peak) แยกส่วนหรือพีกซ้อนได้ ควรเปลี่ยนบัฟเฟอร์เป็น running buffer (20 mM phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4) โดยใช้คอลัมน์ desalting หรือ dialyze ค้างคืนหากจำเป็น อุปกรณ์ Protein Sample Prep และคอลัมน์ desalting จาก Merck สามารถจัดการทั้งเรื่องการปรับความเข้มข้นและเปลี่ยนบัฟเฟอร์ได้ในขั้นตอนเดียว ช่วยประหยัดเวลาก่อนเริ่มการรัน SEC

ตั้งค่าความเข้มข้นโปรตีนไว้ที่ 0.5 ถึง 10 mg/mL ขึ้นอยู่กับความสามารถในการรองรับของคอลัมน์ และคงปริมาตรการฉีดให้อยู่ระหว่าง 1 ถึง 5% ของ CV การใช้ปริมาตรที่มากขึ้นจะทำให้พีกกว้างขึ้นและสูญเสียความละเอียดในการแยก aggregate และโมโนเมอร์ ไม่ว่าคอลัมน์จะถูกปรับสมดุลมาดีเพียงใดก็ตาม

ความแรงไอออนและสารเติมแต่ง

ควรรักษาความแรงไอออน (ionic strength) ให้มี NaCl อยู่ที่ 150 ถึง 300 mM เพื่อยับยั้งการจับกันแบบไม่จำเพาะเจาะจงกับ resin สำหรับโปรตีนที่มีแนวโน้มจะเกาะติดกับคอลัมน์ อาจพิจารณาเติม 0.01 ถึง 0.05% nonionic detergent ในเฟสเคลื่อนที่ หากวิธีนี้ไม่รบกวนการทำ assay ต่อไป

เก็บตัวอย่างที่ 4°C และลดเวลาการพักตัวอย่างก่อนฉีด เตรียมสารตัวอย่างแบบแบ่งใช้ครั้งเดียว (aliquots) จากสต็อกแช่แข็ง และหลีกเลี่ยงการแช่แข็งซ้ำหลายครั้ง ผลึก aggregate จำนวนมากในกราฟ SEC มีจุดเริ่มต้นมาจากการจัดการตัวอย่าง ไม่ใช่ตัวคอลัมน์ เครื่องมือ Recombinant และ Fusion Tag Protein Purification ของ Merck ถือเป็นขั้นตอน capture ขั้นต้นที่สำคัญซึ่งมีผลต่อคุณภาพตัวอย่างที่จะเข้าสู่การ polish ด้วย SEC

การรันการแยกด้วย SEC และการเก็บ fraction

การตรวจวัดและการฉีดตัวอย่าง

ตั้งค่าการตรวจวัด UV ที่ 280 nm สำหรับโปรตีนส่วนใหญ่ หากเป็นโปรตีนที่มี Tryptophan และ Tyrosine ต่ำ การใช้ 220 nm จะให้ความไว (sensitivity) ที่ดีกว่า แต่ต้องระวังว่าการดูดกลืนแสงของบัฟเฟอร์ที่ 220 nm นั้นมีนัยสำคัญและต้องใช้ reference channel ที่เข้ากันได้

1. Prime injection loop ด้วย running buffer และไล่ฟองอากาศออก
2. ค่อยๆ โหลดตัวอย่างลงใน injection loop เพื่อป้องกันการเกิด turbulence ที่หัวคอลัมน์
3. ฉีดตัวอย่างและเปิดเครื่อง fraction collector พร้อมกัน
4. รักษาอัตราการไหลให้คงที่ตามค่าที่กำหนดไว้ คอยสังเกตความดันของระบบ: หากความดันพุ่งสูงกว่า baseline เกิน 20% ระหว่างการรัน ให้ถือว่าเป็นสัญญาณของการอุดตันบางส่วน

การเก็บ fraction

เก็บ fraction ขนาด 0.5 ถึง 1.0 mL สำหรับคอลัมน์ 10 × 300 mm ส่วนคอลัมน์ preparative ขนาดใหญ่กว่า ให้เก็บที่ 0.2 ถึง 0.5% CV ต่อ fraction บันทึกแต่ละ fraction พร้อมปริมาตรที่ชะออกมาในหน่วย CV เพื่อให้ผลลัพธ์สามารถเปรียบเทียบได้โดยตรงข้ามการรันและเครื่องมือ

1. รวม fraction ที่บรรจุพีกหลักของ UV โดยอ้างอิงจากกราฟ calibration เพื่อยืนยันตำแหน่งการแยกเมื่อเทียบกับ Vo
2. ทำการทดสอบ SDS-PAGE หรือ native PAGE อย่างรวดเร็วกับ fraction ของพีกหลักเพื่อยืนยันความบริสุทธิ์และระบุสิ่งเจือปนก่อนรวมเข้าด้วยกัน
3. รวม fraction ของโมโนเมอร์ และตัด fraction ส่วนต้นที่มี aggregate และ fraction ส่วนท้ายที่มีโปรตีนเสื่อมสภาพออก
4. ทำให้ fraction ที่รวมแล้วเข้มข้นขึ้นด้วย centrifugal concentrator (เลือก MWCO ที่เหมาะสม เช่น 10 kDa สำหรับโปรตีน 50 kDa) ที่อุณหภูมิ 4°C
5. เปลี่ยนเป็นบัฟเฟอร์สำหรับจัดเก็บ (storage buffer) หากเฟสเคลื่อนที่ของ SEC ไม่เหมาะสำหรับการเก็บรักษาระยะยาว

ตารางอ้างอิงพารามิเตอร์การรัน

เคล็ดลับและข้อควรระวังเพื่อประสิทธิภาพและการกู้คืน (Recovery) ที่สูง

การใช้ guard filter หรือ in-line filter ขนาด 0.22 µm ก่อนเข้าคอลัมน์จะช่วยดักจับอนุภาคที่อาจทำให้อุดตันตัวกรอง (frit) ของคอลัมน์ ให้เปลี่ยนชิ้นส่วน guard เมื่อความดันหลังคอลัมน์ (backpressure) เพิ่มสูงขึ้นเรื่อยๆ ก่อนที่มันจะส่งผลต่อคอลัมน์หลัก

ควบคุมอุณหภูมิทั้งคอลัมน์และถังเก็บเฟสเคลื่อนที่ แม้แต่การเบี่ยงเบนเพียง 2 ถึง 3°C ระหว่างการรัน ก็สามารถทำให้ baseline absorbance เลื่อนไปและพีก (peak) เคลื่อนตำแหน่งได้เล็กน้อย ทำให้การเปรียบเทียบผลข้ามการรันไม่น่าเชื่อถือ นอกจากนี้อุณหภูมิคอลัมน์ยังส่งผลต่อความหนืดของบัฟเฟอร์และส่งผลต่อความดันของระบบด้วย

บันทึกข้อมูล retention ทั้งหมดในหน่วย CV แทนที่จะเป็นนาที เพื่อให้สามารถเปรียบเทียบผลลัพธ์ข้ามเครื่อง มือ อัตราการไหล และห้องปฏิบัติการได้โดยตรง ในการบันทึกสถานะสุขภาพของคอลัมน์ ให้บันทึกค่า plate count และ asymmetry factor จากชุดโปรตีนมาตรฐานทุกเดือน

การแก้ไขปัญหาทั่วไปใน SEC

สรุป: การทำ SEC เพื่อให้ได้โปรตีนที่บริสุทธิ์อย่างแม่นยำ

workflow ในการทำ SEC protein purification จะสำเร็จหรือล้มเหลวขึ้นอยู่กับขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง การปรับสมดุลคอลัมน์ที่ถูกต้อง, การใช้บัฟเฟอร์ที่เหมาะสม, การควบคุมปริมาตรการฉีด, และการรวม fraction ที่เป็นระเบียบ ทั้งหมดนี้คือปัจจัยที่กำหนดว่าคุณจะได้รับโมโนเมอร์ที่บริสุทธิ์และมีกิจกรรมทางชีวภาพ หรือเพียงแค่ได้ fraction ผสมที่ไม่มีคุณภาพ

รัน calibration standards ก่อนเริ่มทุกโปรเจกต์ บันทึกผลลัพธ์ในหน่วย CV และหมั่นตรวจสอบสุขภาพของคอลัมน์ทุกเดือน นิสัยเหล่านี้จะช่วยให้คุณพบปัญหาก่อนที่มันจะส่งผลต่อตัวอย่างของคุณ เมื่อใช้คอลัมน์ที่ถูกต้อง บัฟเฟอร์ที่ผ่านการกรอง และการเตรียมโปรตีนเข้าอย่างเหมาะสม SEC จะให้ fraction ที่มีความบริสุทธิ์สูงพร้อมสำหรับการทำ characterization, formulation หรือการวิเคราะห์เชิงฟังก์ชันต่อไป

คำถามที่พบบ่อย