Cytotoxicity Assay คืออะไร? วิธีวัดความเป็นพิษต่อเซลล์ในงานวิจัย
คุณมีสารประกอบที่พร้อมสำหรับการทดสอบแล้ว แต่การเลือกรูปแบบ assay ที่ไม่เหมาะสมอาจทำให้ได้ค่า IC50 ที่คลาดเคลื่อน หรือล้มเหลวโดยสิ้นเชิงหากสารประกอบที่มีสีรบกวนการทำงานของสีเคมี การเลือกระหว่าง MTT, WST-8, LDH, ATP และวิธี Imaging นั้นไม่ใช่เรื่องง่ายเมื่อคุณต้องจัดการทั้งปริมาณงาน (throughput), แบบจำลองเซลล์ (cell model) และการเข้าถึงเครื่องมือ บทความนี้จะอธิบายว่า cytotoxicity assay คืออะไร แต่ละวิธีหลักทำงานอย่างไร และวิธีเลือกสิ่งที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทดลองของคุณ
Cytotoxicity assay คืออะไรและวัดค่าอะไรบ้าง?
Cytotoxicity assay คือการทดสอบเชิงปริมาณที่ใช้วัดความเสียหายหรือการสูญเสียความมีชีวิตของเซลล์หลังจากได้รับสารเคมี สารชีวภาพ วัสดุ หรือสารสกัด โดยจะติดตามทั้งการลดลงของตัวบ่งชี้เซลล์ที่มีชีวิต หรือการเพิ่มขึ้นของตัวบ่งชี้เซลล์ที่ตายแล้ว เพื่อให้ได้ค่าตัวเลขที่สะท้อนถึงความเป็นพิษของการทดลองที่ความเข้มข้นต่างๆ
ตัวบ่งชี้ปลายทาง (endpoint) ที่พบบ่อย ได้แก่ กิจกรรมทางเมตาบอลิซึม, ความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์ และระดับ ATP โดยค่าที่อ่านได้จะถูกนำมาพล็อตตามชุดความเข้มข้นเพื่อสร้างกราฟการตอบสนองต่อปริมาณสาร (dose-response curves) ซึ่งนำไปใช้คำนวณค่า IC50 หรือ EC50 เพื่อช่วยในการคัดกรองสาร (hit triage), การจัดอันดับความปลอดภัย และการตัดสินใจเกี่ยวกับความเข้ากันได้ของวัสดุ
Cytotoxicity assay สามารถใช้ได้ทั้งกับแบบจำลอง 2D monolayers และ 3D spheroids ในงานวิจัยพัฒนายา, การควบคุมคุณภาพ และการทดสอบความเข้ากันได้ทางชีวภาพ (biocompatibility) การวัดสามารถทำได้ที่จุดปลายทางจุดเดียวหรือติดตามแบบ Real-time ขึ้นอยู่กับเคมีของ assay และเครื่องมือที่มี หากต้องการมุมมองที่กว้างขึ้นเกี่ยวกับบทบาทของ assay เหล่านี้ในขั้นตอนการทำงานที่เกี่ยวข้องกับเซลล์ โปรดดูผลิตภัณฑ์กลุ่ม Cell Culture Analysis
Cytotoxicity assay ทำงานอย่างไร: แบบจำลอง, สัญญาณที่ตรวจวัด และการควบคุม
โหมดการตรวจจับและสัญญาณ
เคมีของแต่ละ assay จะวัดเหตุการณ์ทางชีวภาพที่แตกต่างกัน Assay กลุ่ม Tetrazolium reduction จะรายงานกิจกรรมทางเมตาบอลิซึม, การรั่วไหลของ LDH จะรายงานความเสียหายของเยื่อหุ้มเซลล์, สัญญาณเรืองแสง (luminescence) ของ ATP จะรายงานสถานะพลังงาน และสีย้อมที่ใช้สำหรับการถ่ายภาพ (imaging-based dyes) จะรายงานจำนวนนิวเคลียสของเซลล์ที่ตายแล้วหรือเซลล์ทั้งหมดในระดับเซลล์เดี่ยว
| วิธี | ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพ | ประเภทสัญญาณ | ความยาวคลื่น / การตรวจจับ | ความเข้ากันได้ของรูปแบบ |
|---|---|---|---|---|
| MTT | กิจกรรมทางเมตาบอลิซึม | การดูดกลืนแสง (Absorbance) | 570 nm | 2D monolayer |
| WST-8 / CCK-8 | กิจกรรมทางเมตาบอลิซึม | การดูดกลืนแสง (Absorbance) | 450 nm | 2D, 3D spheroids |
| LDH release | ความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์ | การดูดกลืนแสง / ฟลูออเรสเซนซ์ | 490 nm (colorimetric) | 2D, การสุ่มตัวอย่างจาก supernatant |
| ATP luminescence | สถานะพลังงาน | การเรืองแสง (Luminescence) | Broadband luminescence | 2D, เซลล์จำนวนน้อย, 3D |
| Live-cell imaging | นิวเคลียส / สีย้อมเซลล์ตาย | ฟลูออเรสเซนซ์ | หลายช่องสัญญาณ | 2D, 3D, kinetic |
สีย้อม Tetrazolium อย่าง MTT และ WST-8 อาศัยการทำงานของ reductase ภายในเซลล์ โดย WST-8 จะเปลี่ยนสภาพเป็นผลิตภัณฑ์ formazan ที่ละลายน้ำได้ ซึ่งช่วยลดขั้นตอนการละลายที่จำเป็นใน MTT และช่วยให้ขั้นตอนการทำงานง่ายขึ้นในกรณีที่ใช้เพลทความหนาแน่นสูง
LDH ที่ปล่อยออกมาในสื่อเพาะเลี้ยงสามารถวัดค่าเชิงสี (colorimetrically) ได้จาก supernatant ทำให้สามารถสุ่มตัวอย่างโดยไม่ทำลายเซลล์ จึงทำให้ LDH เป็นตัวเลือกที่เหมาะสมสำหรับการวัดร่วม (multiplexing) กับค่าอื่นๆ ในเพลท รวมถึงการใช้ Merck assay kits for metabolite and enzyme analysis เมื่อคุณต้องการติดตามการเปลี่ยนแปลงของเมตาบอลิซึมควบคู่ไปกับการตายของเซลล์
ATP luminescence ใช้ปฏิกิริยาที่อาศัย luciferase ซึ่งสัญญาณจะมีความสัมพันธ์โดยตรงกับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิต ให้ความไวสูงและช่วงไดนามิกที่กว้าง พร้อมเวลาในการบ่มสั้นซึ่งเหมาะสำหรับแคมเปญการคัดกรองที่จำกัดเรื่องเวลาหรือสายพันธุ์เซลล์ที่มีกระบวนการเมตาบอลิซึมต่ำ
วิธีที่อาศัยการถ่ายภาพโดยใช้ Live Cell Imaging Reagents ช่วยให้เห็นความละเอียดในระดับเซลล์เดี่ยวทั่วทั้งหลุมเพาะเลี้ยง ทำให้คุณสามารถแยกผลยับยั้งการแบ่งตัวของเซลล์ (cytostatic effects) ออกจากการตายของเซลล์จริงๆ ได้ และช่วยวัดความหลากหลายของประชากรเซลล์ที่ค่าเฉลี่ยจากเครื่องอ่านเพลทอาจมองข้ามไป
การควบคุมและการออกแบบเพลท
วางแผนผังเพลทของคุณโดยใช้การสุ่มตำแหน่งเพื่อลดผลกระทบที่ขอบ (edge effects) หลุมรอบนอกสามารถเติมบัฟเฟอร์ได้หากตู้บ่มเพาะของคุณมีการไล่ระดับอุณหภูมิที่ชัดเจนที่ขอบเพลท
ตรวจสอบค่าการอ่าน (reader settings), อัตราขยาย (gain) และการรับแสงก่อนเริ่มการทำงานจริง สำหรับการออกแบบเชิงจลนศาสตร์ (kinetic) ควรทำการวัดพื้นฐานทันทีหลังจากเติมสารประกอบ แล้วจึงติดตามจุดเวลาหลังการรักษาเพื่อตรวจหาความเป็นพิษที่เกิดขึ้นล่าช้าซึ่งการวัดที่จุดปลายทางเพียงจุดเดียวอาจพลาดไปได้ คำนวณค่า Z-prime จากหลุมควบคุมเพื่อยืนยันคุณภาพของ assay ก่อนเริ่มขยายขนาดการคัดกรอง
การเลือกวิธี cytotoxicity ที่เหมาะสมสำหรับการทดลองของคุณ
ไม่มีวิธี assay ใดที่เหมาะกับทุกสถานการณ์ ควรเลือกวิธีให้เหมาะสมกับชนิดของเซลล์, ประเภทของสารประกอบ, สีของแมทริกซ์, เครื่องมือที่มี และดูว่าคุณต้องการค่าปลายทางเพียงค่าเดียวหรือต้องการข้อมูลเชิงจลนศาสตร์ พิจารณาด้วยว่าผลการวัดจำเป็นต้องทำร่วมกับ marker ของการตายแบบ apoptosis หรือโปรตีนก่อนที่จะเลือกว่าจะใช้รูปแบบใด
คู่มือการตัดสินใจเลือกวิธี cytotoxicity assay
- มีโปรโตคอลที่ผ่านการตรวจสอบในห้องปฏิบัติการแล้ว
- ปริมาณงานต่ำ, แบบจำลอง 2D monolayer
- สารประกอบไม่มีสีและมีกิจกรรม redox ต่ำ
- การคัดกรองปริมาณงานสูงใน 96 หรือ 384 หลุม
- 3D spheroids ที่การแพร่ของผลึก MTT มีข้อจำกัด
- ขั้นตอนการทำงานที่ไม่ต้องการให้ขั้นตอนการละลายทำให้กระบวนการช้าลง
- การจำแนกลักษณะ necrosis และการประเมินความเสียหายของเยื่อหุ้มเซลล์
- การสุ่มตัวอย่างจาก supernatant สำหรับการวัดหลายค่า
- การอ่านค่าโดยไม่ทำลายเซลล์ในหลุมเดิม
- กรณีเซลล์มีจำนวนน้อยหรือสายพันธุ์ที่มีกระบวนการเมตาบอลิซึมต่ำ
- ข้อจำกัดด้านเวลาบ่มสั้นในการคัดกรองที่รวดเร็ว
- ต้องการความไวสูงและช่วงไดนามิกที่กว้าง
- แยกแยะผลยับยั้งการแบ่งตัวจากผลความเป็นพิษ
- การติดตามการเริ่มต้นของความเป็นพิษแบบจลนศาสตร์
- การเก็บข้อมูลความแปรปรวนระหว่างเซลล์ในหลุมเดียว
| วิธี | เครื่องมือที่จำเป็น | ความสามารถเชิงจลนศาสตร์ | ใช้งานกับ 3D ได้ | ความเสี่ยงต่อการรบกวน |
|---|---|---|---|---|
| MTT | เครื่องอ่านการดูดกลืนแสง | ไม่ | จำกัด | สูง (สารประกอบมีสี / สาร redox) |
| WST-8 / CCK-8 | เครื่องอ่านการดูดกลืนแสง | บางส่วน | ใช่ | ปานกลาง |
| LDH release | เครื่องอ่านการดูดกลืนแสง / ฟลูออเรสเซนซ์ | บางส่วน | ใช่ | ต่ำถึงปานกลาง |
| ATP luminescence | เครื่องอ่านสัญญาณเรืองแสง | ไม่ (ต้องทำ lysis) | ใช่ | ต่ำ |
| Live-cell imaging | เครื่องถ่ายภาพฟลูออเรสเซนซ์ | ใช่ | ใช่ | ต่ำ (ขึ้นอยู่กับช่องสัญญาณ) |
การประยุกต์ใช้งานและการออกแบบการทดลองทั่วไป
ในการคัดกรองสารโมเลกุลขนาดเล็ก Cytotoxicity assay จะช่วยจัดลำดับความแรงของสารประกอบและบ่งชี้ช่องว่างของความจำเพาะต่อเซลล์ที่ไม่ใช่เป้าหมาย สำหรับโปรแกรม Antibody-drug conjugate หรือ nanoparticle การสังเกตเชิงจลนศาสตร์ในช่วง 48 ถึง 72 ชั่วโมงช่วยให้บันทึกความเป็นพิษที่เกิดขึ้นล่าช้า ซึ่ง assay ที่วัดเพียงปลายทางอาจพลาดไป
การทดสอบความเข้ากันได้ทางชีวภาพของวัสดุ (biocompatibility) และการทดสอบสารสกัดหรือสารชะจากพลาสติก, ฟิลเตอร์ และท่อ ต่างก็อาศัย Cytotoxicity assay ที่มีรูปแบบเพลทที่สม่ำเสมอและเกณฑ์ผ่าน/ไม่ผ่านที่ชัดเจน การควบคุมคุณภาพในงานอาหารและเภสัชกรรมก็มีข้อกำหนดเรื่องความสามารถในการทำซ้ำและการบันทึกเอกสารเช่นเดียวกัน
เมื่อกลไกมีความสำคัญ ควรวางแผนการทดสอบเพื่อยืนยันด้วยวิธีอื่น การจับคู่ค่าความมีชีวิตเบื้องต้นกับตัวบ่งชี้การตายแบบ apoptosis หรือโปรตีนที่หลั่งออกมาผ่าน immunoassay platform หรือโดยการวิเคราะห์ proteins and enzymes ที่เกี่ยวข้อง จะเพิ่มบริบทเชิงกลไกที่ตัวเลขความมีชีวิตเพียงค่าเดียวไม่สามารถบอกได้
การตั้งค่าและแก้ปัญหาเพื่อข้อมูล cytotoxicity ที่น่าเชื่อถือ
ความหนาแน่นของการเพาะเซลล์ (seeding density) เป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดของสัญญาณที่ไม่อยู่ในช่วงที่กำหนด หากเซลล์น้อยเกินไปจะทำให้ค่าการอ่านเข้าใกล้พื้นหลังสัญญาณรบกวน (noise floor) แต่ถ้ามากเกินไปจะทำให้สัญญาณอิ่มตัวและบีบอัดกราฟการตอบสนองต่อปริมาณสาร ควรออปติไมซ์ความหนาแน่นเพื่อให้หลุมทดสอบทั้งหมดอยู่ในช่วงเชิงเส้นของเส้นมาตรฐานก่อนทำการทดลอง
การควบคุมตัวทำละลาย (solvent control) มีความสำคัญในทุกขั้นตอน ควรรักษาระดับ DMSO ให้อยู่ที่หรือต่ำกว่า 0.1 ถึง 0.5% ขึ้นอยู่กับแบบจำลองเซลล์ของคุณ และตรวจสอบให้แน่ใจว่าสัญญาณการควบคุม vehicle ไม่แตกต่างจากเซลล์ปกติเกิน 10 ถึง 15% ความเข้มข้นของตัวทำละลายที่สูงขึ้นจะส่งผลต่อ cytotoxicity ของตัวเองและทำให้ความแรงของสารประกอบดูสูงเกินจริง
เคล็ดลับด่วน
- 96-well plates: เพาะเซลล์ 2,000 ถึง 10,000 เซลล์ต่อหลุมขึ้นอยู่กับระยะเวลาการเพิ่มจำนวน (doubling time); 384-well plates มักต้องใช้ 500 ถึง 2,000 เซลล์ต่อหลุม
- ใช้สื่อเพาะเลี้ยงที่ไม่มี phenol red สำหรับการทดสอบด้วย tetrazolium และการดูดกลืนแสงเพื่อขจัดสัญญาณรบกวนพื้นหลัง
- สำหรับ WST-8/CCK-8: บ่ม 1 ถึง 4 ชั่วโมงและอ่านที่ 450 nm โดยใช้ 650 nm เป็นตัวอ้างอิง; ขยายเวลาเป็น 4 ถึง 6 ชั่วโมงสำหรับโมเดล 3D หรือเซลล์ที่เมตาบอลิซึมช้า
- สำหรับ LDH assays: หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลาย (freeze-thaw) ของ supernatant และรักษาเวลาการบ่มให้สม่ำเสมอในทุกเพลท
- ปรับสมดุลเพลทที่อุณหภูมิห้องอย่างน้อย 15 นาทีก่อนอ่านสัญญาณ luminescence เพื่อให้สัญญาณพื้นหลังคงที่
- ตั้งค่าอัตรารับแสง (gain) ของเครื่องอ่านโดยใช้หลุมควบคุมที่เป็น positive control ระดับกลาง ไม่ใช่ที่สัญญาณสูงสุด เพื่อหลีกเลี่ยงการอิ่มตัวที่ความเข้มข้นสารประกอบต่ำ
ปรับค่าข้อมูลเข้ากับ vehicle control, ลบค่าการดูดกลืนแสงหรือค่าการเรืองแสงของตัวเปล่า และสร้างแบบจำลอง logistic สี่พารามิเตอร์ (4PL) ให้กับข้อมูลการตอบสนองต่อปริมาณสาร รายงานค่า IC50 พร้อมช่วงความเชื่อมั่น 95% และระบุจำนวนของการทดลองซ้ำ (independent replicates) ตรวจสอบค่าที่ผิดปกติ (outlier) ในแต่ละหลุมก่อนสรุปการสร้างกราฟ
การวัดหลายค่า (Multiplexing) จะเพิ่มความหนาแน่นของข้อมูลโดยไม่ต้องเพิ่มจำนวนหลุม LDH ที่วัดจาก supernatant สามารถวัดก่อนการอ่านค่า ATP หรือ WST-8 จากหลุมเดียวกันได้เมื่อมีการจัดลำดับขั้นตอนการบ่มและ lysis ที่ถูกต้อง ควรวางแผนลำดับก่อนเริ่มเพื่อให้การวัดครั้งแรกไม่รบกวนครั้งที่สอง
ใช้อุปกรณ์ Cell Counting Equipment เพื่อตรวจสอบความแม่นยำในการเพาะเซลล์และตรวจสอบความมีชีวิตเบื้องต้นด้วย trypan blue หรือสีย้อมฟลูออเรสเซนซ์เมื่อสัญญาณ assay มีความคลุมเครือ การนับจำนวนที่แม่นยำตั้งแต่เริ่มต้นจะช่วยขจัดตัวแปรสำคัญได้หนึ่งประการก่อนที่จะเติมสารประกอบ
สำหรับแมทริกซ์โปรตีนที่ซับซ้อนหรือสารสกัดทางชีวภาพ ควรวางแผนขั้นตอนการเจือจางและการจัดการตัวอย่างเพื่อลดผลกระทบจากแมทริกซ์ก่อนการทดสอบเซลล์ ควรบันทึกความแตกต่างระหว่าง Lot ของวัสดุทดสอบทางชีวภาพเนื่องจากการแปรปรวนของ batch อาจเปลี่ยนการตอบสนองพื้นฐานโดยไม่เกี่ยวข้องกับผลของสารประกอบ สำหรับการยืนยันระดับโปรตีนในขั้นตอนถัดไป โปรโตคอลการเตรียมตัวอย่างโปรตีน protein sample preparation จะช่วยให้มั่นใจได้ว่าคุณภาพของตัวอย่างตั้งต้นมีความสม่ำเสมอก่อนการทดสอบในขั้นตอนถัดไป
สรุปและขั้นตอนถัดไป
Cytotoxicity assay คือการวัดปริมาณว่าการทดสอบส่งผลต่อความมีชีวิตของเซลล์อย่างไรผ่านกิจกรรมทางเมตาบอลิซึม, ความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์, สถานะ ATP หรือการถ่ายภาพ วิธีที่ดีที่สุดขึ้นอยู่กับแบบจำลองเซลล์, คุณสมบัติของสารประกอบ และเครื่องมือที่คุณมี ไม่มีวิธีใดที่ดีที่สุดในทุกสถานการณ์ แต่ละวิธีมีข้อดีข้อเสียระหว่างความไว, ปริมาณงาน และความเสี่ยงจากการรบกวน
วางแผนการควบคุมที่แข็งแกร่งตั้งแต่เริ่มต้น, ตรวจสอบความถูกต้องของสัญญาณก่อนขยายขนาด และจับคู่ผลการวัดหลักกับวิธีอื่นที่เหมาะสมเมื่อความจำเพาะหรือกลไกเป็นส่วนหนึ่งของการตัดสินใจ การรวมวิธีเหล่านี้จะช่วยให้คุณได้ข้อมูลที่สามารถสนับสนุนการตัดสินใจได้ในทุกขั้นตอนของโครงการ
คำถามที่พบบ่อย
ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค
ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express
เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ Cytotoxicity จาก Merck, MedChemExpress (MCE) และ Elabscience และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE
Thai 
English