วิธีโครมาโทกราฟี: ขั้นตอนพื้นฐานที่นักวิทยาศาสตร์ต้องรู้
เมื่อถึงเวลาที่ต้องทำการแยกสารภายในสัปดาห์นี้ แต่ทีมงานยังตกลงกันไม่ได้ว่าควรลำดับขั้นตอนอย่างไร เตรียมตัวทำละลายประเภทไหน หรือต้องปรับสมดุลคอลัมน์นานเท่าใด การตัดสินใจเล็กๆ น้อยๆ ในช่วงตั้งต้นอาจทำให้สูญเสียสารตัวอย่างโดยเปล่าประโยชน์ ทำให้งาน QC ล่าช้า และเพิ่มค่าใช้จ่ายตัวทำละลายเกินความจำเป็น คู่มือฉบับนี้จะแจกแจงทุกขั้นตอนของวิธีโครมาโทกราฟี (Chromatography method) ตั้งแต่การวางแผนจนถึงการสรุปผล พร้อมจุดตรวจสอบสำคัญที่ห้องปฏิบัติการของคุณนำไปปรับใช้ได้ทันที
ลำดับขั้นตอนของวิธีโครมาโทกราฟี
วิธีโครมาโทกราฟีมีลำดับขั้นตอนที่ชัดเจน เริ่มต้นด้วยการกำหนดวัตถุประสงค์ในการวิเคราะห์ให้แน่ชัด จากนั้นจึงดำเนินการเลือกเทคนิคที่เหมาะสม เตรียมเฟส เตรียมตัวอย่าง ตั้งค่าเครื่องมือ และตรวจสอบข้อมูล การข้ามขั้นตอนหรือรีบเร่งในขั้นตอนใดขั้นตอนหนึ่งอาจเพิ่มงานแก้ไขและลดความเชื่อมั่นในผลวิเคราะห์
นี่คือลำดับขั้นตอนที่ทุกการทดลองควรปฏิบัติ:
- กำหนดวัตถุประสงค์ ระบุสารวิเคราะห์ที่ต้องการตรวจวัด เมทริกซ์ของตัวอย่าง ความไว (sensitivity) ที่ต้องการ และเกณฑ์การยอมรับที่ผลวิเคราะห์ต้องเป็นไปตามนั้น
- เลือกแนวทางการแยกสาร เลือกว่าจะใช้ TLC, LC หรือ GC รวมถึงรูปแบบที่เหมาะสม เช่น reversed phase หรือ normal phase โดยพิจารณาจากขั้วและคุณสมบัติการระเหยของสารวิเคราะห์
- เลือกเฟสอยู่กับที่ (stationary phase) และเฟสเคลื่อนที่ (mobile phase) เลือกเคมีของเฟสให้สอดคล้องกับ interaction ของสารวิเคราะห์โดยไม่เกินขีดจำกัดของคอลัมน์หรือระบบ
- เตรียมเฟสเคลื่อนที่ กรองผ่านเมมเบรนขนาด 0.2 µm กำจัดก๊าซ (degas) และติดฉลากระบุเลข lot เพื่อการตรวจสอบย้อนกลับ
- เตรียมตัวอย่าง เจือจางหรือสกัดตามความจำเป็น กำจัดอนุภาคด้วยการกรองหรือเหวี่ยงแยก และเลือกตัวทำละลายสำหรับฉีดตัวอย่างให้เข้ากับสภาวะเริ่มต้น
- ตั้งค่าพารามิเตอร์เครื่องมือ กำหนดอุณหภูมิคอลัมน์ อัตราการไหล (flow rate) โปรแกรม gradient หรือ isocratic ความยาวคลื่นตรวจวัด และปริมาตรการฉีด
- ปรับสมดุล (equilibration) และตรวจสอบคุณสมบัติ รันสาร blank และสารมาตรฐาน system suitability ก่อนฉีดตัวอย่างจริง พร้อมตรวจสอบค่า backpressure และความคงที่ของ baseline
- วิเคราะห์และติดตามผล ฉีดตัวอย่างตามลำดับ โดยคอยสังเกตความผิดปกติของ baseline การเปลี่ยนแปลงความดัน หรือ carryover
- ประมวลผลข้อมูล อินทิเกรตพีก (peak) คำนวณ retention factor หรือค่า Rf ตามความเหมาะสม และตรวจสอบผลลัพธ์เทียบกับเกณฑ์การยอมรับ สำหรับคำแนะนำทีละขั้นตอนในการคำนวณค่า Rf ดูได้ที่ วิธีการคำนวณค่า Rf ในโครมาโทกราฟี
- บันทึกข้อมูลทุกอย่าง บันทึกสภาวะของวิธี เลข lot ของสาร ผลการตรวจสอบ system suitability และการเบี่ยงเบนใดๆ เพื่อให้เกิดความสามารถในการทำซ้ำ (reproducibility) และพร้อมสำหรับการตรวจสอบ (audit)
วิธีโครมาโทกราฟีในทางปฏิบัติ
การแยกสารเกิดขึ้นจากการที่สารวิเคราะห์มีการ partitioning ต่างกันระหว่างเฟสอยู่กับที่และเฟสเคลื่อนที่ สารองค์ประกอบที่ทำปฏิกิริยากับเฟสอยู่กับที่ได้แรงกว่าจะเคลื่อนที่ช้ากว่า ทำให้เกิด retention time ที่แตกต่างกัน และความแตกต่างในอัตราการเคลื่อนที่นี้เองที่สร้าง chromatogram ที่นำไปใช้งานได้
ความสามารถในการเลือกแยก (selectivity) มาจากเคมี ทั้ง hydrophobic, polar, ionic, ขนาดโมเลกุล หรือ affinity interaction ล้วนมีส่วนร่วม โดยเฟสเคลื่อนที่จะช่วยส่งเสริมหรือลดผลเหล่านี้ผ่านความแข็งแรงของตัวทำละลาย (solvent strength), pH และสารเติมแต่งที่ส่งผลต่อสถานะการแตกตัวของสารวิเคราะห์
ประสิทธิภาพ (efficiency) เป็นตัวกำหนดว่าพีกจะแหลมหรือกว้าง รูปร่างคอลัมน์ ขนาดอนุภาค อัตราการไหล และการกระจายตัวในระบบล้วนส่งผลต่อประสิทธิภาพ หากประสิทธิภาพต่ำ พีกจะกว้างขึ้นและอาจบดบังสารที่มีการแยกตัวออกมาพร้อมกัน (co-eluting) ได้
ให้มองการแยกสารทุกครั้งผ่าน 3 ตัวแปร ได้แก่ retention, selectivity และ efficiency ปรับองค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่และอุณหภูมิเพื่อปรับค่า retention เปลี่ยนเคมีของเฟสอยู่กับที่เพื่อแก้ไขปัญหา selectivity และปรับอัตราการไหลหรือขนาดคอลัมน์เพื่อเพิ่ม efficiency การจัดการตัวแปรทั้ง 3 นี้ตามลำดับจะช่วยลดเวลาในการพัฒนาวิธีทดลองที่สูญเปล่า
การเลือกเทคนิคที่ถูกต้องก่อนเริ่มต้นจะช่วยประหยัดเวลาได้มากกว่าการมาแก้ไขปัญหาทีหลัง สำหรับคำแนะนำในการเลือกเทคนิคให้เหมาะกับปัญหาการวิเคราะห์ของคุณ ดูได้ที่ เมื่อใดที่ควรใช้โครมาโทกราฟีและวิธีการเลือกเทคนิคที่เหมาะสม
ส่วนประกอบหลักและการตั้งค่า: ตั้งแต่คอลัมน์ไปจนถึงเฟสเคลื่อนที่
การเลือกคอลัมน์และเฟสอยู่กับที่
สำหรับการทำ LC แบบ reversed phase คอลัมน์ C18 จะทำหน้าที่ควบคุม retention ของสารวิเคราะห์ที่มีสมบัติ hydrophobic ผ่านการทำ gradient จากน้ำไปสู่ตัวทำละลายอินทรีย์ ซึ่งยังคงเป็นจุดเริ่มต้นที่ได้รับความนิยมสูงสุดในการพัฒนาวิธีทดลอง ทั้งในอุตสาหกรรมยา อาหาร และการวิเคราะห์สิ่งแวดล้อม
Ascentis® C18 จาก Merck/Sigma-Aldrich เป็นคอลัมน์ที่เชื่อถือได้สำหรับการพัฒนาวิธีทดลอง มีให้เลือกหลายขนาดและหลายขนาดอนุภาค ทำให้คุณสามารถปรับเปลี่ยนจากการตรวจคัดกรองปริมาณมากไปเป็นการยืนยันผลความละเอียดสูงได้โดยไม่ต้องเปลี่ยนเคมีของคอลัมน์
Guard column และตัวกรอง inline ช่วยยืดอายุการใช้งานของคอลัมน์โดยการดักจับอนุภาคและสารจากเมทริกซ์ที่ยึดเกาะแน่นก่อนที่จะเข้าสู่ analytical bed สำหรับงาน LC ทั่วไปในห้องปฏิบัติการไทย การใช้ guard column ช่วยให้คุ้มค่าต่อการลงทุนภายในเวลาไม่กี่สัปดาห์
หาก workflow ของคุณเกี่ยวข้องกับ Liquid Chromatography แต่ยังไม่แน่ใจว่า LC หรือ HPLC แบบใดที่เหมาะกับระบบของคุณ ข้อมูลเปรียบเทียบที่ Liquid Chromatography vs HPLC: ข้อแตกต่าง หลักการ และการใช้งาน เป็นแหล่งข้อมูลที่มีประโยชน์ก่อนที่คุณจะเลือกใช้คอลัมน์
การเตรียมเฟสเคลื่อนที่และคุณภาพของตัวทำละลาย
เกรดของตัวทำละลายมีความสำคัญมากกว่าที่หลายห้องปฏิบัติการคาดคิด ตัวทำละลายคุณภาพต่ำจะนำมาซึ่งสารเจือปนที่ดูดกลืน UV ทำให้เกิด ghost peak และยก baseline ให้สูงขึ้น โดยเฉพาะที่ความยาวคลื่นต่ำกว่า 220 nm การเปลี่ยนไปใช้ตัวทำละลายเกรด HPLC ที่ผ่านการรับรองมักจะช่วยแก้ปัญหา baseline ได้โดยไม่ต้องปรับเปลี่ยนส่วนอื่น
LiChrosolv® Solvents จาก Merck ผ่านการทดสอบความโปร่งแสง UV ที่สม่ำเสมอและความสามารถในการทำซ้ำระหว่าง batch สำหรับการวิเคราะห์ที่ไวต่อ UV หรือวิธี gradient ที่ baseline ต้องมีความเสถียร การใช้ตัวทำละลายจากแหล่งที่ควบคุมได้จะช่วยกำจัดตัวแปรที่ก่อให้เกิดปัญหาในการ troubleshoot ออกไปได้หนึ่งอย่าง
ปรับค่า pH ของบัฟเฟอร์ให้สอดคล้องกับค่า pKa ของสารวิเคราะห์ และตรวจสอบช่วงความเสถียรของ pH ในคอลัมน์ก่อนเริ่มงาน ประเภทและความเข้มข้นของเกลือส่งผลต่อ ion pairing และอาจเปลี่ยนลำดับการชะออก (elution order) ระหว่าง batch ได้ ควรเตรียมบัฟเฟอร์ใหม่ทุกครั้ง กรองผ่านเมมเบรน 0.2 µm และกำจัดก๊าซด้วยเครื่องสุญญากาศ, helium sparging หรือการกำจัดก๊าซแบบ inline ก่อนใช้งาน
การตั้งค่าระบบและการปรับสมดุล
ติดตั้งระบบโดยให้มี dead volume ต่ำสุดและตรวจสอบว่าข้อต่อทุกจุดไม่มีการรั่วซึมก่อนเติมตัวทำละลาย กรอกค่า gradient delay volume ในไฟล์วิธีทดลองเพื่อให้มั่นใจว่า gradient ที่ตั้งโปรแกรมไว้จะถึงคอลัมน์ตรงกับที่เครื่องรายงาน
ปรับสมดุลด้วย eluent เริ่มต้นจนกระทั่ง backpressure และ baseline คงที่ รันการฉีดแบบ blank จากนั้นตามด้วยสารมาตรฐาน system suitability ก่อนฉีดตัวอย่างจริง ยืนยันว่า retention time, รูปร่างพีก และจำนวนทฤษฎีทางทฤษฎี (plate count) เป็นไปตามเกณฑ์ที่กำหนด
| ขนาดคอลัมน์ | ขนาดอนุภาค | อัตราการไหลปกติ | ช่วงความดันที่คาดการณ์ | ลักษณะการใช้งาน |
|---|---|---|---|---|
| 150 × 4.6 mm | 5 µm | 1.0 mL/min | 100 to 200 bar | การพัฒนาวิธี HPLC มาตรฐาน |
| 150 × 4.6 mm | 3 µm | 0.8 to 1.0 mL/min | 150 to 300 bar | ต้องการความละเอียดสูงขึ้นโดยใช้เครื่องมือเดิม |
| 100 × 2.1 mm | 1.7 to 1.8 µm | 0.3 to 0.5 mL/min | 400 to 800 bar | UHPLC, คัดกรองรวดเร็ว, ปริมาตรตัวอย่างน้อย |
| 50 × 4.6 mm | 5 µm | 1.5 to 2.0 mL/min | 50 to 100 bar | ตรวจสอบ QC รวดเร็ว, throughput สูง |
เคล็ดลับการตั้งค่าเบื้องต้น
- กรองและกำจัดก๊าซในตัวทำละลายทั้งหมดก่อนใช้งาน รวมถึงน้ำและบัฟเฟอร์
- ปรับสภาพคอลัมน์ด้วย eluent เริ่มต้นอย่างน้อย 10 เท่าของปริมาตรคอลัมน์
- ติดตั้ง guard column เพื่อป้องกันคอลัมน์วิเคราะห์จากสิ่งสกปรกในเมทริกซ์
- ควบคุมให้ตัวทำละลายในตัวอย่างมีค่าความแข็งแรงเท่ากับหรืออ่อนกว่าเฟสเคลื่อนที่เริ่มต้น
- ติดตามความดันและ baseline อย่างต่อเนื่องระหว่างการปรับสมดุล
- ล้างเข้าสู่ตัวทำละลายสำหรับเก็บรักษาทันทีหลังจากสิ้นสุดการวิเคราะห์
การประยุกต์ใช้งานและเมื่อใดที่ควรใช้ TLC, LC หรือ GC ในห้องปฏิบัติการไทย
การเลือกเทคนิคคือการตัดสินใจเชิงปฏิบัติ ไม่ใช่ทฤษฎี TLC เหมาะสำหรับการตรวจสอบเอกลักษณ์อย่างรวดเร็ว, การทำโปรไฟล์สิ่งเจือปน, และการติดตามผลปฏิกิริยาเมื่อข้อมูลกึ่งปริมาณ (semi-quantitative) เพียงพอและมีการจำกัดเวลาเข้าถึงเครื่องมือ ส่วน LC สามารถครอบคลุมช่วงขั้วของสารที่กว้างในเมทริกซ์ที่ซับซ้อน จึงเป็นมาตรฐานสำหรับงาน QC ยาและความปลอดภัยทางอาหาร ส่วน GC เน้นสารที่ระเหยง่าย (volatile) และกึ่งระเหยได้ง่าย โดยให้ความละเอียดสูงและเข้ากับระบบ MS ได้โดยตรงสำหรับงานสารตกค้างและยาฆ่าแมลง
คู่มือการตัดสินใจเลือกใช้ TLC vs LC vs GC สำหรับห้องปฏิบัติการทั่วไปในไทย
- ติดตามผลปฏิกิริยาและตรวจสอบเอกลักษณ์เบื้องต้น
- คัดกรองสิ่งเจือปนอย่างรวดเร็วโดยไม่เสียเวลาเครื่อง
- การประเมินเบื้องต้นที่มีปริมาณต่ำและต้นทุนต่ำ
- งานด้านการสอนและการทดสอบความเป็นไปได้
- การวิเคราะห์ทางยาและสารที่เกี่ยวข้อง
- การวิเคราะห์ปริมาณสารเติมแต่งในอาหารและสารปนเปื้อน
- เมทริกซ์ที่มีน้ำเป็นส่วนประกอบและต้องการการเตรียมตัวอย่าง
- การตรวจสอบตามวิธีในตำรับยา (Pharmacopeia)
- การทดสอบตัวทำละลายตกค้างตามมาตรฐาน ICH Q3C
- การคัดกรองยาฆ่าแมลงในผลผลิตทางการเกษตร
- การทำโปรไฟล์กลิ่นและรสชาติ
- การวิเคราะห์สารอินทรีย์ระเหยง่าย (VOC) ในสิ่งแวดล้อม
สำหรับ workflow ของ LC ที่มีจำนวนตัวอย่างสูง คุณภาพของตัวทำละลายส่งผลโดยตรงต่อเวลาการทำงานของเครื่องมือ HPLC/UHPLC Solvents จาก TCI เป็นทางเลือกที่คุ้มค่าสำหรับวิธี gradient ทั่วไปและการวิเคราะห์ปริมาณมาก ช่วยให้ห้องปฏิบัติการหลีกเลี่ยง noise บน baseline และความเสียหายของคอลัมน์ที่เกิดจากรีเอเจนต์คุณภาพต่ำกว่า
ปรับแนวทางเทคนิคของคุณให้สอดคล้องกับกรอบระเบียบข้อบังคับที่เกี่ยวข้อง ตำรับยามักระบุวิธี LC พร้อมข้อกำหนด system suitability ที่ชัดเจน การตรวจสอบความปลอดภัยทางอาหารอาจต้องการการยืนยันผลด้วย LC-MS หรือ GC-MS วิธีการทางสิ่งแวดล้อมมีโปรโตคอลที่กำหนดไว้เฉพาะ เมื่อปรับขยายจากขั้นตอนการพัฒนาไปสู่การใช้งานประจำวัน ให้ควบคุมตัวแปรสำคัญไว้: เลข lot ของคอลัมน์, องค์ประกอบและ pH ของเฟสเคลื่อนที่, โปรไฟล์ gradient, การตั้งค่า detector, และเกณฑ์ system suitability
สรุปเนื้อหาสำคัญ
วิธีโครมาโทกราฟีทำงานเป็นลำดับขั้นตอนที่เชื่อมโยงกัน ไม่ใช่แค่เช็คลิสต์ วัตถุประสงค์ที่ชัดเจนจะนำไปสู่การเลือกเทคนิคที่เหมาะสม และเทคนิคที่เลือกจะกำหนดเคมีของเฟส ซึ่งจะส่งผลต่อไปยังการเตรียมตัวทำละลายและการตั้งค่า ทุกขั้นตอนล้วนขึ้นอยู่กับขั้นตอนก่อนหน้า
ควบคุมตัวแปรที่คุณสามารถวัดได้ ทั้งประเภทคอลัมน์ เกรดตัวทำละลาย pH ของเฟสเคลื่อนที่ โปรแกรม gradient และประสิทธิภาพของระบบ บันทึกผลการรันแต่ละครั้งอย่างสม่ำเสมอเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ทำซ้ำได้และอ้างอิงได้ ห้องปฏิบัติการที่สร้างนิสัยเหล่านี้ตั้งแต่ต้นจะประหยัดเวลาในการแก้ปัญหาได้มากในระยะยาว
คำถามที่พบบ่อย
ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค
ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express
เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ General Chromatography จาก Merck และ TCI และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE
Thai 
English