Thin Layer Chromatography (TLC): วิธีใช้ Monitor ปฏิกิริยาใน Organic Chemistry

เมื่อคุณกำลังรันปฏิกิริยาเคมี มีตัวจับเวลานับถอยหลัง และต้องตัดสินใจว่าจะหยุดปฏิกิริยา (quench) ตอนนี้หรือรันต่อดี การตัดสินใจที่ผิดพลาดอาจทำให้คุณเสียสารเคมี เสียเวลา หรือในบางครั้งอาจหมายถึงต้องทิ้งผลิตภัณฑ์ทั้งชุด คู่มือนี้จะให้ขั้นตอนการทำงานที่ชัดเจนสำหรับการทำ TLC chromatography reaction monitoring ตั้งแต่การสุ่มตัวอย่าง การเลือกตัวทำละลาย ไปจนถึงการแปลผลที่มั่นใจได้ว่าจะรันต่อหรือหยุด

วิธีติดตามปฏิกิริยาเคมีด้วย TLC

TLC chromatography reaction monitoring คือการนำตัวอย่างขนาดเล็กจากส่วนผสมในปฏิกิริยามาจุดลงบนแผ่นซิลิกาตามช่วงเวลาที่กำหนด เพื่อติดตามการหายไปของสารตั้งต้น (starting material) และการปรากฏขึ้นของผลิตภัณฑ์ หากทำอย่างถูกต้อง การใช้แผ่น TLC เพียงแผ่นเดียวจะช่วยให้คุณเห็นภาพรวมของการเปลี่ยนแปลงได้ภายในเวลาไม่ถึง 10 นาที วิธีที่เชื่อถือได้มากที่สุดคือการทำ 3 เลน (lane) บนแผ่นเดียว

ให้จุดสาร 3 เลนบนแผ่นเดียวกัน ได้แก่ สารตั้งต้น (SM), ตัวอย่างจากปฏิกิริยา (RXN) และจุดผสม (co-spot) ของทั้งสองตัวเข้าด้วยกัน พยายามรักษาขนาดจุดให้เล็ก คมชัด และเรียงอยู่บนเส้น baseline เดียวกัน เลน co-spot คือวิธีที่รวดเร็วที่สุดในการยืนยันว่าจุดสองจุดนั้นเป็นสารชนิดเดียวกันหรือเป็นคนละสารกัน

ในการสุ่มตัวอย่าง ให้ดูดสารออกมา 10 ถึง 50 µL ทำการ quench หากจำเป็น (ดูหมายเหตุเรื่องการสุ่มตัวอย่างด้านล่าง) เจือจางในตัวทำละลายที่ระเหยง่าย เช่น ethyl acetate หรือ dichloromethane แล้วจุดลงแผ่นทันที นำไปพัฒนา (develop) จนกระทั่ง solvent front อยู่เกือบถึงขอบบนของแผ่น

ตรวจสอบด้วย UV ก่อน แล้วค่อยใช้ stain หากจำเป็น ปฏิกิริยาพร้อมสำหรับการ work up เมื่อจุดของ SM หายไปหรือเหลือเพียงร่องรอยเล็กน้อยเมื่อเทียบกับแถบผลิตภัณฑ์ พยายามปรับตัวทำละลายให้ผลิตภัณฑ์มีค่า Rf อยู่ที่ 0.2 ถึง 0.4 เพราะช่วง Rf นี้จะให้ความแตกต่างระหว่างจุดที่ชัดเจนที่สุดเพื่อช่วยให้ตัดสินใจได้อย่างมั่นใจ

กฎการเลือกค่า Rf: หากผลิตภัณฑ์ของคุณมีค่า Rf สูงกว่า 0.6 จุดของสารข้างเคียงอาจจะซ้อนทับกันใกล้กับ solvent front หากต่ำกว่า 0.15 ความคมชัดกับสิ่งเจือปนที่มีขั้วจะแย่ลง ควรปรับขั้วของตัวทำละลายก่อนเริ่มทำการติดตาม ไม่ใช่ปรับหลังจากนั้น

หลักการทำงานของ TLC และความหมายของค่า Rf

ซิลิกาเจลจะยึดเหนี่ยวสารที่มีขั้วสูงผ่านพันธะไฮโดรเจนและแรงไดโพล ส่วนสารที่มีขั้วน้อยกว่าจะเคลื่อนที่ได้ไกลกว่าบนแผ่นในตัวทำละลายที่กำหนด ค่า Rf คือระยะทางที่สารเคลื่อนที่หารด้วยระยะทางที่ solvent front เคลื่อนที่ ค่า Rf ที่สูงหมายถึงการยึดเหนี่ยวบนซิลิกาน้อยกว่า

การเปลี่ยนความแรงของตัวทำละลายจะส่งผลต่อค่า Rf อย่างคาดการณ์ได้ การเพิ่มสัดส่วนของ ethyl acetate ใน hexanes หรือ methanol ใน dichloromethane จะเพิ่มค่า Rf สำหรับสารที่มีขั้ว ควรปรับทีละ 5 ถึง 10% เพื่อป้องกันไม่ให้เปลี่ยนขั้วมากเกินไปจนจุดทั้งหมดรวมกันเป็นแถบเดียวใกล้กับ solvent front

สำหรับคำแนะนำเบื้องต้นเกี่ยวกับหลักการของ Thin layer chromatography และวิธีการแยกสาร สามารถดูได้ที่คู่มือ Thin Layer Chromatography (TLC): นิยามและวิธีการติดตามปฏิกิริยา หากคุณต้องการเปรียบเทียบ TLC กับ Paper Chromatography สามารถดูได้ที่ Paper Chromatography: ความหมายและการใช้งาน ซึ่งอธิบายรายละเอียดขั้นตอนการทำงานไว้ครบถ้วน

กฎการเตรียม Chamber: ทำเครื่องหมาย baseline ด้วยดินสอเท่านั้น ปรับสมดุลไอระเหย (pre-saturate) ใน chamber ทิ้งไว้ 5 ถึง 10 นาทีก่อนเริ่มพัฒนาแผ่น รักษาไม่ให้ระดับ solvent สูงเกินกว่า baseline หยุดการพัฒนาเมื่อ solvent front อยู่ห่างจากขอบบนประมาณ 5 ถึง 10 มม.

หากจุดซ้อนทับกัน อย่าเพิ่งด่วนสรุปผล ให้เปลี่ยนกลุ่มตัวทำละลาย (เช่น เปลี่ยนจาก hexanes/EtOAc เป็น toluene/acetone) หรือเติม modifier เล็กน้อย เช่น 1% acetic acid สำหรับสารที่เป็นกรด หรือ 0.5% triethylamine สำหรับสารที่เป็นเบส บันทึกทุกการเปลี่ยนแปลง: ชนิดของแผ่น TLC, อัตราส่วน eluent และค่า Rf หากไม่มีการบันทึก การรันครั้งต่อไปจะไม่สามารถนำมาเปรียบเทียบกันได้

การเตรียมการใช้งานจริง: แผ่น TLC, Mobile phase, การสุ่มตัวอย่าง และการพัฒนา

การเลือกแผ่น TLC

สำหรับการติดตามปฏิกิริยาเคมีทั่วไป Merck TLC Silica Gel 60 G Plates บนแผ่นแก้วให้ค่า Rf ที่สม่ำเสมอในตัวทำละลายมาตรฐาน ขนาดอนุภาคที่สม่ำเสมอของ Silica Gel 60 ทำให้การเคลื่อนที่ของจุดเชื่อถือได้และทำซ้ำได้ ซึ่งหมายความว่าค่า Rf ที่คุณบันทึกไว้ในวันนี้จะตรงกับการรันครั้งหน้าภายใต้สภาวะเดียวกัน ความสม่ำเสมอนี้ทำให้การตัดสินใจไปต่อหรือหยุดนั้นมีความน่าเชื่อถือ

แผ่นที่รองหลังด้วยอลูมิเนียมจะตัดขนาดได้ง่ายกว่าและจัดการในตู้ดูดควัน (fume hood) ได้สะดวกกว่า แผ่นแก้วจะทนทานต่อสาร stain ที่กัดกร่อนได้ดีกว่าและทนต่อการใช้ปืนความร้อน (heat gun) ซ้ำๆ ได้ดีกว่า ให้เลือกรูปแบบที่เหมาะสมกับโปรโตคอลการทำ stain ของคุณ

การเลือก Mobile phase

เริ่มต้นการเลือกตัวทำละลายโดยใช้ค่าความมีขั้วเป็นตัวนำทาง ตารางด้านล่างให้จุดเริ่มต้นที่เป็นประโยชน์สำหรับปฏิกิริยาเคมีทั่วไป

ระบบตัวทำละลาย	เป้าหมาย Rf ทั่วไป	เหมาะสำหรับ
Hexanes / Ethyl acetate (9:1 to 7:3)	0.2 to 0.5 สำหรับสารออร์แกนิกที่ไม่มีขั้ว	Alkenes, esters, ethers, อะโรมาติกอย่างง่าย
Hexanes / Ethyl acetate (1:1 to 3:7)	0.2 to 0.5 สำหรับสารที่มีขั้วปานกลาง	Alcohols, ketones, สารตัวกลางที่มีขั้วปานกลาง
Dichloromethane / Methanol (19:1 to 9:1)	0.2 to 0.5 สำหรับสารที่มีขั้วสูง	Amides, amines, สารตัวกลางที่มีขั้วสูง
Toluene / Ethyl acetate (4:1 to 1:1)	0.2 to 0.5	สารที่แยกได้ยากในระบบ hexanes

การสุ่มตัวอย่างสารตัวกลางอย่างปลอดภัย

สำหรับปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับสาร Grignard, การลดทอนด้วย borohydride หรือสารตัวกลางที่ไวต่อความชื้น ให้ทำการ quench ตัวอย่างก่อนจุดลงแผ่น โดยเติมสารละลาย NH₄Cl อิ่มตัวหรือน้ำปริมาณเล็กน้อยลงในตัวอย่างก่อนเจือจาง เพื่อป้องกันไม่ให้สารตกค้างที่ไวต่อปฏิกิริยาสร้างรอยเปื้อน (streaking) หรือทำลายชั้นซิลิกา

ทำให้แผ่นที่จุดสารแห้งด้วยกระแสลมเย็นสั้นๆ ก่อนนำไปพัฒนา หากมีน้ำหรือตัวทำละลายโปรติก (protic solvents) ค้างอยู่ในจุด จะทำให้เกิดการเปื้อนและค่า Rf ที่ผิดเพี้ยน

เคล็ดลับสำหรับการได้แผ่น TLC ที่สม่ำเสมอ

ทำเครื่องหมาย baseline ด้วยดินสอเบาๆ ที่ความสูง 10 มม. จากขอบด้านล่าง
ใช้หลอดแคปิลลารีขนาดเล็กและจุดสาร 2-3 ครั้งเบาๆ แทนการจุดปริมาณมากในครั้งเดียว
เป่าให้แต่ละจุดแห้งสนิทก่อนทำการจุดครั้งต่อไป
อย่าใส่สารเยอะเกินไป จุดที่จางอ่านผลได้ง่ายกว่าจุดที่เปื้อนหรือจุดที่ใหญ่เกินไป
ปรับสมดุลไอระเหยใน chamber อย่างน้อย 5 นาที ก่อนใส่แผ่น
บันทึกองค์ประกอบและอัตราส่วนตัวทำละลายลงบนหลังแผ่นหรือสมุดจดแล็บทันทีหลังพัฒนาเสร็จ

สำหรับรายละเอียดการคำนวณค่า Rf และวิธีการใช้อย่างสม่ำเสมอ สามารถดูได้ที่ วิธีคำนวณค่า Rf ใน Chromatography: สูตรและคู่มือขั้นตอนอย่างละเอียด

การแปลผลแผ่น TLC และการตัดสินใจ

การอ่านผลจาก 3 เลน

เปรียบเทียบเลน SM, RXN และ co-spot โดยวางเทียบกัน ปฏิกิริยาที่เสร็จสมบูรณ์จะดูได้จากการหายไปของจุด SM ในเลน RXN หรือลดลงเหลือเพียงร่องรอยจางๆ เมื่อเทียบกับแถบผลิตภัณฑ์ แถบผลิตภัณฑ์ที่สะอาดโดยไม่มีจุดของสารข้างเคียงอยู่ด้านล่างคือผลลัพธ์ที่ดีที่สุด

หากเลน SM และผลิตภัณฑ์ซ้อนทับกันที่ค่า Rf เดียวกัน อย่าเพิ่งสรุปว่าปฏิกิริยาเสร็จสมบูรณ์ การซ้อนทับกันนั้นอาจเป็นการชะที่ออกมาพร้อมกัน (co-elution) ไม่ใช่การเปลี่ยนไปเป็นผลิตภัณฑ์ ให้เปลี่ยนความขั้วของตัวทำละลายหรือเปลี่ยนระบบก่อนด่วนสรุป

การเลือก Stain ให้เหมาะสม

การตรวจด้วย UV ที่ 254 nm จะตรวจจับสารที่ว่องไวต่อ UV ได้รวดเร็วและไม่ทำลายตัวอย่าง สำหรับสารที่ไม่มี chromophores จะต้องใช้สารย้อม (stain) ทางเคมี สารละลาย stain พร้อมใช้ของ TCI ช่วยประหยัดเวลาในการเตรียม สารแต่ละชนิดถูกเตรียมมาในความเข้มข้นที่พร้อมใช้งานได้ทันทีหลังจากการพัฒนา

Stain	กลุ่มฟังก์ชันเป้าหมาย	การใช้งาน
KMnO₄ (Potassium Permanganate Solution, TCI P1483)	สารอินทรีย์ที่เกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันได้: alkenes, alcohols, amines, sulfides, thiols	ไม่ต้องใช้ความร้อน
Ninhydrin (Ethanol Solution, TCI N0719)	Primary และ secondary amines, amino acids, กลุ่มอะมิโนที่ถูกป้องกันด้วย Boc หลังจากการกำจัดกลุ่มป้องกัน	ใช้ความร้อนหลังจากการจุ่ม
CAM (Ceric Ammonium Molybdate Solution, TCI C1794)	ตอบสนองในวงกว้างเกือบทุกกลุ่มฟังก์ชัน	ใช้ความร้อนหลังจากการจุ่ม

ใช้ stain อย่างเบามือและสม่ำเสมอ การจุ่มแช่ไว้นานเกินไปอาจทำให้สีพื้นหลังเข้มขึ้นจนบดบังจุดสารที่จางๆ ได้ สำหรับปฏิกิริยาการสังเคราะห์เอมีน (amine synthesis) Ninhydrin เป็นเครื่องมือที่เลือกใช้ได้เฉพาะเจาะจงที่สุด: มันจะย้อมเฉพาะสารที่มีกลุ่ม primary หรือ secondary amine ทำให้จุดของสารข้างเคียงไม่กวนการแปลผล สำหรับการคัดกรองทั่วไปที่ยังไม่ทราบชนิดกลุ่มฟังก์ชัน CAM คือตัวเลือกเริ่มต้นที่ใช้งานได้จริงที่สุด

วิธีวิเคราะห์แบบใดที่เหมาะสมกับการติดตามปฏิกิริยาของคุณ?

TLC

ตัดสินใจเร็วว่าจะทำต่อหรือหยุดระหว่างทำปฏิกิริยา
ต้นทุนต่ำ ไม่ต้องใช้เครื่องมือ
ดูหลายตัวอย่างได้พร้อมกัน
ให้ผลกึ่งเชิงปริมาณ (semi-quantitative)

HPLC

ได้เปอร์เซ็นต์การเปลี่ยนและข้อมูลความบริสุทธิ์ที่แม่นยำ
จำเป็นเมื่อผลิตภัณฑ์และ SM เกิด co-elute บน TLC
ใช้เวลานานกว่าและต้นทุนต่อตัวอย่างสูงกว่า

NMR

ยืนยันโครงสร้างผลิตภัณฑ์ได้อย่างชัดเจน
วิเคราะห์เชิงปริมาณได้ด้วย internal standard
ช้าที่สุด ใช้ยืนยันผลจาก TLC หรือ HPLC

คำเตือนเรื่องความแม่นยำ: ให้เปรียบเทียบการเปลี่ยนผ่านเฉพาะบนแผ่นที่รันด้วยชนิดแผ่นเดียวกัน องค์ประกอบตัวทำละลายเดียวกัน และเวลาในการปรับสมดุล chamber ที่เท่ากัน แม้การเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในอัตราส่วนตัวทำละลายหรือความชื้นก็อาจทำให้ค่า Rf เปลี่ยนแปลงจนแปลผลผิดพลาดได้

หากคุณกำลังตัดสินใจว่า Thin layer chromatography เป็นเทคนิคที่เหมาะสมสำหรับงานของคุณหรือไม่ สามารถดูได้ที่ เมื่อใดที่คุณควรใช้โครมาโทกราฟี? การเลือกเทคนิคที่เหมาะสม ซึ่งเปรียบเทียบเทคนิค TLC, HPLC, GC และวิธีอื่นๆ ไว้อย่างชัดเจน

สรุปรายการตรวจสอบสำหรับการตรวจสอบปฏิกิริยาด้วย TLC อย่างรวดเร็ว

เตรียมแผ่นและตัวทำละลายให้พร้อมก่อนเริ่มปฏิกิริยา พยายามตั้งเป้าหมาย Rf ของผลิตภัณฑ์ไว้ใกล้ 0.3 จุดที่วิ่งสูงเกินไปหรือต่ำเกินไปจะลดความสามารถในการแยกสารตัวกลางและสารข้างเคียงออกจากกัน

รันเลน SM, เลนตัวอย่าง RXN และ co-spot คู่กันเสมอ บันทึกอัตราส่วนตัวทำละลายและค่า Rf ไว้ที่หลังแผ่นหรือในสมุดจดแล็บอิเล็กทรอนิกส์ทันที บันทึกนี้คือสิ่งที่ทำให้ TLC chromatography reaction monitoring สามารถทำซ้ำได้โดยผู้ปฏิบัติงานหลายคนและในหลายวัน

ตรวจด้วย UV ก่อนเสมอ เพิ่ม stain แบบจำเพาะเมื่อ UV ไม่เพียงพอ หรือเมื่อต้องการการยืนยันกลุ่มฟังก์ชัน หากการแปลผลยังไม่ชัดเจน ให้ปรับตัวทำละลายทีละน้อยหรือยืนยันด้วย HPLC หรือ NMR การควบคุมแต่ละขั้นตอนคือสิ่งที่เปลี่ยนความรู้สึกเชิงคุณภาพให้กลายเป็นการตัดสินใจในกระบวนการที่เชื่อถือได้

คำถามที่พบบ่อย

ฉันควรสุ่มตัวอย่างปฏิกิริยาเพื่อทำ TLC บ่อยแค่ไหน?

ให้สุ่มตัวอย่างเมื่อเคมีของปฏิกิริยาบ่งชี้ถึงการเปลี่ยนแปลง โดยทั่วไปทุก 10 ถึง 30 นาทีในช่วงเริ่มต้น และบ่อยขึ้นเมื่อใกล้ถึงจุดเสร็จสิ้น สำหรับปฏิกิริยาที่รวดเร็ว เช่น การลดทอน (reductions) หรือ acylations ให้ดึงตัวอย่างน้อยๆ ทุก 5 ถึง 10 นาทีในช่วงท้าย การทำปฏิกิริยาเลยจุดเสร็จสิ้นอาจนำไปสู่การเสื่อมสภาพของผลิตภัณฑ์ ซึ่งการตรวจสอบครั้งเดียวในช่วงท้ายอาจตรวจไม่พบ

ถ้าผลิตภัณฑ์และสารตั้งต้นมีค่า Rf เท่ากันบน TLC ของฉันต้องทำอย่างไร?

ก่อนอื่นให้เปลี่ยนความขั้วหรือกลุ่มตัวทำละลาย การเติม modifier เล็กน้อย เช่น 0.1% triethylamine สำหรับสารที่เป็นเบส หรือ 1% acetic acid สำหรับสารที่เป็นกรด มักจะช่วยแก้ปัญหาการ co-elution ได้ หากยังคงซ้อนทับกันอยู่ ให้ยืนยันการเปลี่ยนผ่านด้วย HPLC หรือ NMR แทนการฝืนแปลผลจาก TLC

ควรใช้ stain ชนิดใดเพื่อตรวจหา functional group ทั่วไป?

KMnO₄ ช่วยให้เห็นสารออร์แกนิกที่เกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันได้หลายชนิดโดยไม่ต้องใช้ความร้อน และเป็น stain อเนกประสงค์ที่ใช้งานได้จริงที่สุดสำหรับสารที่มองไม่เห็นด้วย UV Ninhydrin ใช้สำหรับตรวจหา primary และ secondary amines โดยเฉพาะ จึงเป็นตัวเลือกแรกสำหรับการสังเคราะห์กรดอะมิโนหรือเอมีน CAM ให้การตอบสนองที่กว้างสำหรับกลุ่มฟังก์ชันส่วนใหญ่หลังจากใช้ความร้อน และเป็นค่าเริ่มต้นที่เชื่อถือได้เมื่อไม่ทราบกลุ่มฟังก์ชันที่แน่นอน

ฉันสามารถวัดปริมาณการเปลี่ยนแปลงของปฏิกิริยาด้วย TLC ได้หรือไม่?

TLC ให้ผลได้ดีที่สุดในระดับกึ่งเชิงปริมาณเท่านั้น โดยใช้การเปรียบเทียบความเข้มของจุดหรือการใช้ densitometry เบื้องต้น สำหรับเปอร์เซ็นต์การเปลี่ยนผ่านที่แม่นยำหรือข้อมูลความบริสุทธิ์ ให้ใช้ HPLC, GC หรือ NMR ร่วมกับ internal standard ที่เหมาะสม TLC เหมาะที่สุดสำหรับใช้เป็นตัวเช็คแบบรวดเร็ว: เสร็จสมบูรณ์ หรือ ยังไม่เสร็จสมบูรณ์

ทำไมจุดบน TLC ของฉันถึงเป็นเส้นหรือหาง (tailing) ระหว่างการทำ reaction monitoring?

การจุดสารปริมาณมากเกินไปบนแผ่นเป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุด: ให้ลดปริมาณตัวอย่างหรือเจือจางเพิ่มก่อนจุด นอกจากนี้เกลือตกค้างหรือตัวทำละลายโปรติกในตัวอย่างก็เป็นสาเหตุให้เกิดรอยเปื้อน ดังนั้นควรตรวจสอบให้แน่ใจว่าตัวอย่างที่ไวต่อปฏิกิริยาถูก quench อย่างเหมาะสมและจุดบนแผ่นแห้งดีแล้วก่อนนำไปพัฒนา การเติม modifier เล็กน้อยลงใน eluent (0.1% triethylamine สำหรับสารเบส) สามารถช่วยแก้ปัญหาการเกิดหางที่เกิดจากการดูดซับรุนแรงบนซิลิกาได้

ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ

ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดด้านล่างจัดจำหน่ายผ่าน Chemical Express Thailand ส่งคำถาม สำหรับราคา ความพร้อมจำหน่าย หรือคำแนะนำทางเทคนิค

Merck

TLC Silica Gel 60 G Plates

TCI

TCI

TCI

ผลิตภัณฑ์แนะนำจาก Chemical Express

เราจัดส่งผลิตภัณฑ์ Thin Layer Chromatography (TLC) จาก Merck และ TCI และแบรนด์ชั้นนำระดับสากลอื่นๆ หลากหลายชนิดทั่วประเทศไทย สอบถามหรือสั่งซื้อได้ผ่านแบบฟอร์มสอบถาม หรือพูดคุยกับเราได้ทันทีทาง LINE

ส่งคำถาม เพิ่มเพื่อน LINE